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Klinischer Nutzen von Remdesivir bei mit SARS infizierten Rhesusaffen

Aug 11, 2023

Nature Band 585, Seiten 273–276 (2020)Diesen Artikel zitieren

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Wirksame Therapien zur Behandlung der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) werden dringend benötigt. Während viele Prüfpräparate, zugelassene und wiederverwendete Arzneimittel als potenzielle Behandlungen vorgeschlagen wurden, können präklinische Daten aus Tiermodellen die Suche nach wirksamen Behandlungen leiten, indem sie diejenigen ausschließen, denen es in vivo an Wirksamkeit mangelt. Remdesivir (GS-5734) ist ein Nukleotidanalogon-Prodrug mit breiter antiviraler Aktivität1,2, das derzeit in klinischen Studien zu COVID-19 untersucht wird und kürzlich von der US-amerikanischen Food and Drug Administration eine Notfallzulassung erhalten hat3,4. In Tiermodellen war Remdesivir wirksam gegen Infektionen mit dem Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) und dem Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus (SARS-CoV)2,5,6. In vitro hemmte Remdesivir die Replikation von SARS-CoV-27,8. Hier untersuchen wir die Wirksamkeit von Remdesivir in einem Rhesusaffen-Modell einer SARS-CoV-2-Infektion9. Im Gegensatz zu mit Vehikel behandelten Tieren zeigten mit Remdesivir behandelte Makaken keine Anzeichen einer Atemwegserkrankung; Sie zeigten auch reduzierte Lungeninfiltrate auf Röntgenaufnahmen und reduzierte Virustiter in bronchoalveolären Spülungen zwölf Stunden nach der ersten Dosis. Die Virusausscheidung aus den oberen Atemwegen wurde durch die Remdesivir-Behandlung nicht reduziert. Bei der Autopsie hatten mit Remdesivir behandelte Tiere eine geringere Viruslast in der Lunge und weniger Lungenschäden. Somit hatte eine früh während der Infektion begonnene Behandlung mit Remdesivir einen klinischen Nutzen bei mit SARS-CoV-2 infizierten Rhesusaffen. Obwohl das Rhesusaffen-Modell nicht die schwere Erkrankung darstellt, die bei einigen Patienten mit COVID-19 beobachtet wird, unterstützen unsere Daten den frühzeitigen Beginn der Remdesivir-Behandlung bei Patienten mit COVID-19, um das Fortschreiten einer Lungenentzündung zu verhindern.

Wir haben kürzlich ein Rhesusaffenmodell für die SARS-CoV-2-Infektion erstellt9. In diesem Modell entwickeln infizierte Rhesusaffen eine leichte bis mittelschwere, vorübergehende Atemwegserkrankung mit pulmonalen Infiltraten, die auf Röntgenaufnahmen sichtbar sind, und einem Ausscheidungsmuster, das dem bei Patienten mit COVID-19 beobachteten ähnelt. Die beobachteten klinischen Symptome und hohen Viruslasten ermöglichen die Prüfung der Behandlungswirksamkeit direkt wirkender antiviraler Medikamente in diesem Modell.

Zwei Gruppen von sechs Rhesusaffen wurden mit dem SARS-CoV-2-Stamm nCoV-WA1-2020 geimpft. Zwölf Stunden nach der Inokulation erhielt eine Gruppe 10 mg kg-1 intravenöses Remdesivir und die andere Gruppe wurde mit einem gleichen Volumen Vehikellösung (2 ml kg-1) behandelt. Die Behandlung wurde 12 Stunden nach der ersten Behandlung und danach alle 24 Stunden mit einer Dosis von 5 mg kg-1 Remdesivir oder einem gleichen Volumen Vehikellösung (1 ml kg-1) fortgesetzt. Die Konzentration von Remdesivir wurde im Serum bestimmt, das 12 Stunden nach der ersten Behandlung und 24 Stunden nach den nachfolgenden Dosen (unmittelbar vor der Verabreichung der nächsten Behandlungsdosis) entnommen wurde. Remdesivir (Prodrug GS-5734), sein nachgeschalteter Alaninmetabolit (GS-704277) und das Ausgangsnukleosid (GS-441524) wurden im Serum aller mit Remdesivir behandelten Tiere nachgewiesen (Extended Data Abb. 1a). Die Serumspiegel des Prodrugs und der nachgeschalteten Metaboliten stimmten mit zuvor veröffentlichten Plasmaspiegeln dieser Verbindungen bei gesunden Rhesusaffen überein, die eine kurze systemische Halbwertszeit für GS-5734 (0,39 Stunden) aufwiesen, was zu einer vorübergehenden Umwandlung in das Zwischenprodukt GS-704277 und führte Persistenz des Downstream-Produkts GS-441524 bei höheren Plasmaspiegeln10.

Die Konzentrationen des Metaboliten GS-441524 wurden in Lungengewebe gemessen, das aus jedem Lungenlappen sieben Tage nach der Inokulation (dpi) und 24 Stunden nach Verabreichung der letzten Remdesivir-Dosis entnommen wurde; Der Metabolit war bei allen mit Remdesivir behandelten Tieren leicht nachweisbar. GS-441524 war im Allgemeinen in allen sechs Lungenlappen verteilt (Extended Data Abb. 1b). GS-704277 wurde im Lungengewebe nicht nachgewiesen. Obwohl der pharmakologisch aktive Metabolit von Remdesivir das Triphosphat von GS-441524 ist, zeigten mit dem Triphosphat-Metaboliten versetzte Lungenhomogenatproben einen schnellen Zerfall des Metaboliten in dieser Matrix (Daten nicht gezeigt). GS-441524-Spiegel wurden als Ersatz für die Gewebebelastung herangezogen und legen nahe, dass die aktuelle Dosierungsstrategie Arzneimittelmetaboliten an die Stellen der SARS-CoV-2-Replikation in infizierten Tieren transportiert.

Nach der Impfung mit SARS-CoV-2 wurde den Tieren verblindet eine tägliche klinische Bewertung auf der Grundlage eines vorab erstellten Bewertungsbogens zugewiesen. Zwölf Stunden nach der ersten Verabreichung von Remdesivir waren die klinischen Ergebnisse bei mit Remdesivir behandelten Tieren signifikant niedriger als bei Kontrolltieren, die Vehikellösung erhielten. Dieser Unterschied im klinischen Score blieb während der gesamten Studie bestehen (Abb. 1a). Nur eines der sechs mit Remdesivir behandelten Tiere zeigte leichte Dyspnoe, wohingegen Tachypnoe und Dyspnoe bei allen mit Vehikel behandelten Kontrollen beobachtet wurden (erweiterte Datentabelle 1). Röntgendiagnostische Lungeninfiltrate sind eines der Kennzeichen von COVID-19 beim Menschen. Röntgenaufnahmen mit 0, 1, 3, 5 und 7 dpi zeigten bei mit Remdesivir behandelten Tieren eine deutlich geringere Lungenlappenbeteiligung und eine weniger schwere Lungeninfiltration als bei mit Vehikel behandelten Tieren (Abb. 1b, c).

a, Tägliche klinische Ergebnisse für Tiere, die mit SARS-CoV-2 infiziert und mit Remdesivir (rote Kreise, n = 6) oder Vehikellösung (schwarze Quadrate, n = 6) behandelt wurden. b, kumulative Röntgenbewertungen. Ventrodorsale und laterale Röntgenaufnahmen wurden von einem klinischen Tierarzt nach einem Standardbewertungssystem auf das Vorhandensein von Lungeninfiltraten bewertet (0, normal; 1, leichte interstitielle Lungeninfiltrate; 2, mittelschwere Lungeninfiltrate, möglicherweise mit teilweiser Verwischung der Herzgrenze und kleinen Lungenbereichen). Konsolidierung; 3, schwere interstitielle Infiltrate, große Bereiche pulmonaler Konsolidierung, Alveolarmuster und Luftbronchogramme). Einzelne Lappen wurden bewertet und die Ergebnisse pro Tier und Tag wurden summiert und angezeigt. c, ventrodorsale Röntgenaufnahmen für jedes Tier, aufgenommen mit 7 dpi. Bereiche mit pulmonaler Infiltration sind eingekreist. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak durchgeführt.

Bei 1, 3 und 7 dpi wurde eine bronchoalveoläre Lavage (BAL) als Indikator für die Virusreplikation in den unteren Atemwegen durchgeführt. Obwohl die Viruslast bei BAL bei mit Remdesivir behandelten Tieren verringert war, war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (Abb. 2a). Allerdings war der infektiöse Virustiter in BAL 12 Stunden nach der ersten Remdesivir-Behandlung bei mit Remdesivir behandelten Tieren etwa 100-fach niedriger als bei den Kontrolltieren. Bei 3 dpi konnte im BAL von mit Remdesivir behandelten Tieren kein infektiöses Virus mehr nachgewiesen werden, während im BAL von vier von sechs Kontrolltieren immer noch Virus nachgewiesen werden konnte (Abb. 2b). Trotz dieser Verringerung der Virusreplikation in den unteren Atemwegen gab es keine Verringerung der Viruslast oder des infektiösen Virustiters in Nasen-, Rachen- oder Rektalabstrichen, die von mit Remdesivir behandelten Tieren entnommen wurden, mit Ausnahme eines signifikanten Unterschieds im Virustiter in den Rachenabstrichen, die bei Tieren entnommen wurden 1 dpi und bei Viruslasten in Rachenabstrichen, die mit 4 dpi gesammelt wurden (Extended Data Abb. 2).

a, b, Viruslasten (a) und infektiöse Virustiter in BAL (b), gesammelt von Rhesusaffen, die mit SARS-CoV-2 infiziert und mit Remdesivir (n = 6) oder Vehikellösung (n = 6) behandelt wurden. TCID50, 50 % Gewebekultur-Infektionsdosis. Die statistische Analyse wurde mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak durchgeführt. c, Viruslasten in Geweben, die aus allen sechs Lungenlappen bei der Autopsie auf 7 dpi von Rhesusaffen entnommen wurden, die mit SARS-CoV-2 infiziert und mit Remdesivir (n = 6) oder Vehikellösung (n = 6) behandelt wurden. Die statistische Analyse wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests durchgeführt. Mittelbalken, Median.

Alle Tiere wurden mit 7 dpi eingeschläfert. Aus jedem Lungenlappen wurden Gewebeproben entnommen, um die Virusreplikation zwischen mit Remdesivir behandelten und mit Vehikel behandelten Tieren zu vergleichen. In 10 von 36 Lungenlappenproben von mit Remdesivir behandelten Tieren konnte keine virale RNA nachgewiesen werden, während dies nur in 3 von 36 Lungenlappenproben von Kontrolltieren der Fall war. Im Allgemeinen zeigte der Vergleich zwischen einzelnen Lungenlappen in den beiden Gruppen einen niedrigeren geometrischen Mittelwert der viralen RNA in der mit Remdesivir behandelten Gruppe (Erweiterte Daten, Abb. 3a). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Viruslast in den Lungen von mit Remdesivir behandelten Tieren signifikant niedriger war als in denen von mit Vehikel behandelten Kontrollen (Abb. 2c). Das Virus konnte aus Lungenlappen von fünf von sechs mit Vehikel behandelten Kontrolltieren isoliert werden, jedoch nicht aus Lungengewebe von mit Remdesivir behandelten Tieren. Obwohl quantitative PCR mit reverser Transkription (qRT-PCR) zeigte, dass bei mit Remdesivir behandelten Tieren weniger Gewebe aus anderen Positionen im Atemtrakt positiv auf virale RNA waren als bei Kontrollen, waren diese Unterschiede statistisch nicht signifikant (Extended Data Abb. 3b).

Bei der Autopsie mit 7 dpi wurden die Lungen grob auf Läsionen untersucht. Bei einem von sechs mit Remdesivir behandelten Tieren wurden grobe Lungenläsionen beobachtet. Im Gegensatz dazu wiesen alle sechs mit Vehikel behandelten Kontrolltiere sichtbare Läsionen auf, was zu einem statistisch signifikanten Unterschied im Bereich der von Läsionen betroffenen Lunge führte (Abb. 3a, b, Erweiterte Daten Abb. 4a, b). Dieser Unterschied zeigte sich auch bei der Berechnung des Verhältnisses von Lungengewicht zu Körpergewicht als Indikator für eine Lungenentzündung; Dieses Verhältnis war bei mit Remdesivir behandelten Tieren signifikant niedriger als bei mit Vehikel behandelten Tieren (Extended Data Abb. 4c). Histologisch gesehen wiesen die mit Remdesivir behandelten Tiere weniger und weniger schwere Läsionen auf als die mit Vehikel behandelten Kontrollen. Bei drei von sechs mit Remdesivir behandelten Tieren fehlten histologische Lungenläsionen; Die drei verbleibenden Tiere entwickelten eine minimale Lungenpathologie. Die Läsionen bei diesen Tieren wurden als weit voneinander entfernte, minimale interstitielle Pneumonie charakterisiert, die häufig in subpleuralen Räumen lokalisiert war (Abb. 3c, e). Fünf von sechs mit Vehikel behandelten Tieren entwickelten eine multifokale, leichte bis mittelschwere interstitielle Pneumonie (Abb. 3d, f). Wir konnten bei allen Tieren, unabhängig von der Behandlung, virales Antigen in einer kleinen Anzahl von Typ-I- und Typ-II-Pneumozyten und Alveolarmakrophagen nachweisen (Abb. 3g, h).

Mit SARS-CoV-2 infizierte und mit Remdesivir (links, n = 6) oder Vehikellösung (rechts, n = 6) behandelte Rhesusaffen wurden auf 7 dpi eingeschläfert. a, b: Repräsentative Rückenansichten der Lunge eines mit Remdesivir behandelten Tieres (a) und eines mit Vehikel behandelten Tieres mit fokal ausgedehnten Konsolidierungsbereichen (b, Kreise). An drei Schnitten von sechs Lungenlappen jedes der sechs Tiere pro Behandlungsgruppe wurde eine histologische Analyse durchgeführt und repräsentative Bilder für c–h ausgewählt. c: Minimale subpleurale interstitielle Pneumonie (Kasten), beobachtet bei drei von sechs mit Remdesivir behandelten Tieren. d: Moderate subpleurale interstitielle Pneumonie mit Ödem (Kasten), beobachtet bei fünf von sechs mit Vehikel behandelten Tieren. e, eingerahmter Bereich von c mit Alveolen, ausgekleidet mit Typ-II-Pneumozyten (Pfeil) und Alveolarräumen mit schaumigen Makrophagen (Pfeilspitze). f, Eingerahmter Bereich von d mit durch Ödeme erweitertes Lungeninterstitium und mäßiger Anzahl von Makrophagen und Neutrophilen. Alveolen sind mit Pneumozyten vom Typ II ausgekleidet (Pfeile). Alveolarräume sind mit Ödemen (Sternchen) und einer geringen Anzahl von Lungenmakrophagen (Pfeilspitze) gefüllt. g, Virusantigen in Typ-I-Pneumozyten (Pfeil) und Typ-II-Pneumozyten (Pfeilspitze) eines mit Remdesivir behandelten Tieres. h, virales Antigen in Typ-I-Pneumozyten (Pfeil) und Makrophagen (Pfeilspitze) eines mit Vehikel behandelten Tieres. Maßstabsbalken: c, d, 200 μm; e–h, 20 μm.

Wir haben erfolgreich eine Tiefensequenzierung an Proben aller mit Remdesivir behandelten Tiere und mit Vehikel behandelten Kontrollen durchgeführt. Bekannte Mutationen in der RNA-abhängigen RNA-Polymerase, die bei Coronaviren eine Resistenz gegen Remdesivir11 verleihen, wurden in keiner der getesteten Proben nachgewiesen (Ergänzungstabelle 1).

Remdesivir ist unseres Wissens die erste antivirale Behandlung, die in einem Tiermodell von COVID-19 eine nachgewiesene Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2 gezeigt hat. Die Behandlung von mit SARS-CoV-2 infizierten Rhesusaffen mit Remdesivir reduzierte klinische Erkrankungen und Schäden an der Lunge. Die bei Rhesusaffen verwendete Remdesivir-Dosierung entspricht der beim Menschen verwendeten. Aufgrund der akuten Natur der Erkrankung bei Rhesusaffen ist es jedoch schwierig, den Zeitpunkt der Behandlung direkt auf die entsprechenden Krankheitsstadien beim Menschen zu übertragen. In unserer Studie wurde die Behandlung nahe dem Höhepunkt der Virusreplikation in der Lunge verabreicht, was durch die Viruslast in bronchoalveolären Lavagen angezeigt wurde, und die ersten Auswirkungen der Behandlung auf klinische Symptome und Virusreplikation wurden innerhalb von 12 Stunden beobachtet. Die Wirksamkeit direkt wirkender antiviraler Medikamente gegen akute virale Atemwegsinfektionen nimmt typischerweise mit Verzögerungen beim Behandlungsbeginn ab12. Daher sollte die Behandlung mit Remdesivir bei Patienten mit COVID-19 so früh wie möglich begonnen werden, um den maximalen Behandlungseffekt zu erzielen.

Trotz des Fehlens offensichtlicher respiratorischer Anzeichen und einer verringerten Virusreplikation in der Lunge von mit Remdesivir behandelten Tieren kam es zu keiner Verringerung der Virusausscheidung. Dieser Befund ist für das Patientenmanagement von großer Bedeutung, da eine klinische Verbesserung nicht als mangelnde Infektiosität interpretiert werden sollte. Obwohl wir gezeigt haben, dass Remdesivir-Metaboliten in den unteren Atemwegen vorkommen, wurden die Arzneimittelspiegel in den oberen Atemwegen nicht charakterisiert und es sollten neuartige Formulierungen mit alternativen Wegen der Arzneimittelabgabe in Betracht gezogen werden, um die Verteilung in den oberen Atemwegen zu verbessern und dadurch die Ausscheidung zu reduzieren und das mögliche Übertragungsrisiko. Da eine schwere COVID-19-Erkrankung jedoch aus einer Virusinfektion der Lunge resultiert, ist dieses Organ das Hauptziel der Remdesivir-Behandlung. Die Bioverfügbarkeit und Schutzwirkung von Remdesivir in der Lunge infizierter Rhesusaffen unterstützen die Behandlung von COVID-19-Patienten mit Remdesivir. In einer klinischen Studie mit Patienten mit schwerer COVID-19-Erkrankung führte die Behandlung mit Remdesivir nicht zu einer klinischen Verbesserung; Allerdings zeigte eine andere klinische Studie, an der mehr Patienten teilnahmen, dass die Behandlung mit Remdesivir zu einer kürzeren Zeit bis zur Besserung führte als bei Patienten, die nur die Standardversorgung erhielten14. Unsere Ergebnisse bei Rhesusaffen deuten darauf hin, dass eine Behandlung mit Remdesivir so früh wie klinisch möglich in Betracht gezogen werden sollte, um das Fortschreiten einer Lungenentzündung bei Patienten mit COVID-19 zu verhindern.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Rocky Mountain Laboratories, NIH, genehmigt und von zertifiziertem Personal in einer von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International akkreditierten Einrichtung gemäß den Richtlinien der Institution durchgeführt Verwendung von Tieren gemäß den Richtlinien und Grundprinzipien im NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, dem Animal Welfare Act, dem United States Department of Agriculture und der United States Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Rhesusaffen wurden in benachbarten einzelnen Primatenkäfigen in einem klimatisierten Raum mit einem festen Hell-Dunkel-Zyklus (12 Stunden hell – 12 Stunden dunkel) untergebracht, um soziale Interaktionen zu ermöglichen. Die Tiere wurden während des gesamten Experiments mindestens zweimal täglich überwacht. Handelsübliches Affenfutter, Leckereien und Obst wurden zweimal täglich von geschultem Personal bereitgestellt. Wasser stand nach Belieben zur Verfügung. Die Bereicherung der Umwelt bestand aus einer Vielzahl menschlicher Interaktionen, Manipulationen, kommerziellem Spielzeug, Videos und Musik. Das Institutional Biosafety Committee (IBC) genehmigte die Arbeit mit infektiösen SARS-CoV-2-Stämmen unter BSL3-Bedingungen. Die Probeninaktivierung wurde gemäß den von der IBC genehmigten Standardarbeitsanweisungen für die Entfernung von Proben aus Hochsicherheitsbehältern durchgeführt.

Um die Wirkung der Remdesivir-Behandlung auf den Ausgang der SARS-CoV-2-Erkrankung zu bewerten, verwendeten wir das kürzlich etablierte Rhesusaffen-Modell der SARS-CoV-2-Infektion, die zu einer vorübergehenden Erkrankung der unteren Atemwege führt9. Da es sich um ein Modell mit wenigen Vordaten handelt, war es nicht möglich, eine Leistungsanalyse zur Bestimmung der Gruppengröße durchzuführen. Die Stichprobengröße basierte daher auf Erfahrungen mit anderen nichtmenschlichen Primatenmodellen für Atemwegserkrankungen, hauptsächlich einem Rhesusaffen-Modell von MERS-CoV, bei dem n = 6 statistische Signifikanz ergab. Zwölf Tiere wurden zufällig zwei Gruppen zugeordnet und wie zuvor beschrieben mit einer Gesamtdosis von 2,6 × 106 TCID50 (50 % Infektionsdosis der Gewebekultur) des SARS-CoV-2-Stammes nCoV-WA1-2020 intranasal, oral, okular und intratracheal geimpft Routen. Die Wirksamkeit der therapeutischen Remdesivir-Behandlung wurde in zwei Gruppen von sechs erwachsenen Rhesusaffen (jeweils drei Männchen und drei Weibchen; 3,6–5,7 kg) getestet. Aufgrund der akuten Natur des SARS-CoV-2-Modells bei Rhesusaffen wurde die therapeutische Behandlung 12 Stunden nach der Inokulation mit SARS-CoV-2 begonnen und einmal täglich für 6 dpi fortgesetzt. Eine Gruppe von Rhesusaffen wurde mit einer Initialdosis von 10 mg/kg Remdesivir behandelt, gefolgt von einer täglichen Erhaltungsdosis von 5 mg/kg. Die andere Gruppe von sechs Tieren diente als infizierte Kontrolle und erhielt ein gleiches Dosisvolumen (d. h. 2 ml/kg Aufsättigungsdosis und danach 1 ml/kg) Vehikellösung (12 % Sulfobutylether-β-cyclodextrin in Wasser und Salzsäure). , pH 3,5) nach dem gleichen Behandlungsplan. Dieses Dosierungsschema bei Rhesusaffen ahmt die tägliche Dosierung nach, die in klinischen Studien mit Patienten mit COVID-19 getestet wurde, und führt zu einer ähnlichen systemischen Arzneimittelexposition. Die Behandlung erfolgte als intravenöse Bolusinjektion (Gesamtdosis über etwa 5 Minuten verabreicht), abwechselnd in die linke oder rechte Kopfvene oder Saphena-Vene verabreicht. Obwohl die hier verwendete Remdesivir-Behandlungsdauer bei Rhesusaffen kürzer ist als die standardmäßige 10-Tage-Behandlungsdauer bei Patienten, wurde diese kürzere Behandlungsdauer gewählt, um eine Beurteilung der Lungenpathologie zu einem Zeitpunkt nach der Inokulation zu ermöglichen, in dem noch Lungeninfiltrate und interstitielle Pneumonie vorhanden wären. Aktuelle Daten aus klinischen Studien haben gezeigt, dass eine 5-tägige Behandlungskur bei Patienten mit COVID-1914 einen ähnlichen klinischen Nutzen hat wie eine 10-tägige Behandlungskur.

Die Tiere wurden zweimal täglich auf klinische Anzeichen einer Krankheit untersucht, wobei ein standardisiertes Bewertungsblatt wie zuvor beschrieben verwendet wurde9; Dieselbe Person, die keine Ahnung von der Gruppenzuordnung der Tiere hatte, beurteilte die Tiere während der gesamten Studie. Der vorgegebene Endpunkt für dieses Experiment war 7 dpi. Während der Behandlung wurden täglich Nasen-, Rachen- und Rektalabstriche entnommen. Klinische Untersuchungen wurden mit 0, 1, 3, 5 und 7 dpi an anästhesierten Tieren durchgeführt. An den Untersuchungstagen wurden klinische Parameter wie Körpergewicht, Temperatur, Pulsoximetrie, Blutdruck und Atemfrequenz sowie dorsoventrale und seitliche Röntgenaufnahmen des Brustkorbs erhoben. Die Röntgenaufnahmen wurden von einem klinischen Tierarzt analysiert, der keine Kenntnis von der Gruppenzuordnung der Tiere hatte. Bei 1, 3 und 7 dpi wurde eine BAL mit 10 ml steriler Kochsalzlösung durchgeführt. Nach dem Tod wurden mit 7 dpi Autopsien an den Tieren durchgeführt. Der Prozentsatz der groben Lungenläsionen wurde von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen ermittelt, der keine Kenntnis von der Gruppenzuordnung der Tiere hatte, und es wurden Proben der folgenden Gewebe entnommen: Halslymphknoten, Bindehaut, Nasenschleimhaut, Oropharynx, Mandeln, Luftröhre, alle Lungenlappen , mediastinaler Lymphknoten, rechter und linker Bronchus, Herz, Leber, Milz, Niere, Magen, Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum, Blinddarm, Dickdarm und Harnblase. Die histopathologische Analyse der Gewebeschnitte wurde von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen durchgeführt, der keine Kenntnis von der Gruppenzuordnung der Tiere hatte.

Das SARS-CoV-2-Isolat nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)15 (Vero-Passage 3) wurde freundlicherweise von den Centers for Disease Control (CDC) zur Verfügung gestellt und einmal in Vero E6-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma) vermehrt ) ergänzt mit 2 % fötalem Rinderserum (Gibco), 1 mM L-Glutamin (Gibco), 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin (Gibco) (Virusisolationsmedium). Der verwendete Virusstamm war zu 100 % identisch mit der ursprünglich hinterlegten GenBank-Sequenz (MN985325.1) und es wurden keine Verunreinigungen festgestellt. VeroE6-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin, gehalten.

Remdesivir (RDV; GS-5734) wurde bei Gilead Sciences vom Department of Process Chemistry (Alberta, Kanada) unter Good Manufacturing Practice (GMP)-Bedingungen hergestellt. Chargennummer 5734-BC-1P wurde in 12 % Sulfobutylether-β-cyclodextrin in Wasser gelöst und die passende Vehikellösung wurde dem NIH zur Verfügung gestellt.

Tributylamin wurde von Millipore Sigma bezogen. Wasser, Aceton, Methanol, Isopropanol und Essigsäure in LC-MS-Qualität wurden über Fisher Scientific bezogen. Alle synthetischen Standards für die molekulare Analyse wurden von Gilead Sciences Inc. bereitgestellt. Serum und gereinigte Lungenhomogenate wurden vor der Analyse mit Gammastrahlen (2 MRad) bestrahlt, um möglicherweise in diesen Proben vorhandene infektiöse Viren zu inaktivieren. Proben wurden für die Analyse kleiner Moleküle vorbereitet, indem ein 50-μl-Aliquot von Serum oder geklärtem Lungenhomogenat mit 950 μl 50 % Aceton, 35 % Methanol, 15 % Wasser (v/v) auf Eis verdünnt wurde. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann 5 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert. Die geklärten Überstände (850 μl) wurden gewonnen und in einem Savant DNA120 SpeedVac-Konzentrator (Thermo Fisher) zur Trockne gebracht. Die Proben wurden in 100 μl 50 % Methanol, 50 % Wasser (v/v) resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Der Überstand wurde zur LC-MS-Analyse in ein Probenfläschchen gegeben. Die Proben wurden mithilfe einer Ionenpaar-Flüssigkeitschromatographie-Strategie auf einem Sciex ExionLC AC-System getrennt. Die Proben wurden auf eine Waters Atlantis T3-Säule (100 Å, 3 μm, 3 mm × 100 mm) injiziert und unter Verwendung eines binären Gradienten aus 5 mM Tributylamin, 5 mM Essigsäure in 2 % Isopropanol, 5 % Methanol, 93 % Wasser eluiert ( v/v) auf 100 % Isopropanol über 5,5 Min. Die Analyten wurden mit einem Sciex 5500 QTRAP-Massenspektrometer im Negativmodus gemessen. Die Überwachung mehrerer Reaktionen wurde unter Verwendung von zwei Signalpaaren für jeden Analyten durchgeführt und die Signaltreue wurde durch Sammeln ausgelöster Produkt-Ionen-Spektren und Vergleich mit Spektren synthetisch reiner Standards bestätigt.

Alle Analyten wurden anhand einer Acht-Punkte-Kalibrierungskurve des jeweiligen synthetischen Standards, der in der Zielmatrix (d. h. Serum oder geklärtes Lungenhomogenat) hergestellt wurde, quantifiziert und auf die gleiche Weise wie experimentelle Proben verarbeitet. Die Quantifizierungsgrenze (LOQ) wurde bei einem Signal-Rausch-Verhältnis von 10 angenähert. Die LOQs für die gemessenen Moleküle in jeder Matrix betrugen 5 nM für GS-441524 sowohl im Lungenhomogenat als auch im Serum, 1 nM für GS-704277 sowohl im Lungenhomogenat als auch im Serum Serum und 0,08 nM für GS-5734 im Serum. Die Instabilität von GS-5734 und dem triphosphorylierten Nukleotidmetaboliten im Lungenhomogenat während der Gewebelyse verhinderte den Nachweis dieser Metaboliten im Lungengewebe.

Die RNA wurde aus Abstrichtupfern und BAL mit dem QiaAmp Viral RNA Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Gewebe (30 mg) wurden in RLT-Puffer homogenisiert und die RNA mit dem RNeasy-Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Zum Nachweis viraler RNA wurden 5 μl RNA in einem einstufigen Echtzeit-RT-PCR-E-Assay16 unter Verwendung des Rotor-Gene-Sondenkits (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. In jedem Lauf wurden parallel Standardverdünnungen von RNA-Standards durchgeführt, die durch digitale Tröpfchen-PCR gezählt wurden, um die Kopienzahlen in den Proben zu berechnen.

Virustitrationen wurden durch Endpunkttitration in Vero E6-Zellen durchgeführt. Das Gewebe wurde in 1 ml DMEM unter Verwendung eines TissueLyser (Qiagen) homogenisiert. Die Zellen wurden mit zehnfachen Reihenverdünnungen von Abstrich- und BAL-Proben beimpft. Die Virusisolierung wurde an Lungengeweben durchgeführt, indem das Gewebe in 1 ml DMEM homogenisiert und Vero E6-Zellen in einer 24-Well-Platte mit 250 μl geklärtem Homogenat und einer 1:10-Verdünnung davon beimpft wurden. Eine Stunde nach der Beimpfung der Zellen wurde das Inokulum entfernt und durch 100 μl (Virustitration) oder 500 μl Virusisolationsmedium ersetzt. Sechs Tage nach der Inokulation wurde der CPE bewertet und der TCID50 berechnet.

An Rhesusaffengewebe wurden Histopathologie und Immunhistochemie durchgeführt. Nach mindestens 7-tägiger Fixierung in 10 % neutral gepuffertem Formalin und Einbettung in Paraffin wurden die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Zum Nachweis des SARS-CoV-2-Antigens wurde eine Immunhistochemie mit einem maßgeschneiderten Kaninchen-Antiserum gegen SARS-CoV-2 N in einer Verdünnung von 1:1.000 durchgeführt. Die gefärbten Objektträger wurden von einem staatlich geprüften Veterinärpathologen analysiert.

Virale RNA wurde wie oben beschrieben extrahiert. cDNAs wurden wie beschrieben mit geringfügigen Modifikationen hergestellt17. Kurz gesagt, 3–12 μl extrahierter RNA wurden mit Ribo-Zero Gold H/M/R (Illumina) von rRNA befreit und dann mit Zufallshexameren und SuperScript IV (ThermoFisher Scientific) revers transkribiert. Nach der RNaseH-Behandlung wurde die Zweitstrangsynthese unter Verwendung des Klenow-Fragments (New England Biolabs) durchgeführt und die resultierenden doppelsträngigen cDNAs wurden mit einer kombinierten Mischung aus RiboShredder RNase Blend (Lucigen) und RNase, DNase-frei, hochkonzentriert (Roche Diagnostics, Indianapolis) behandelt , IN) und dann mittels Ampure XP-Perlenreinigung (Beckman Coulter) gereinigt. Zur Herstellung von Sequenzierungsbibliotheken aus den doppelsträngigen cDNAs wurde das HyperPlus-Bibliotheksvorbereitungskit von Kapa (Roche Sequencing Solutions) verwendet. Um das Multiplexing zu erleichtern, wurde die Adapterligatur mit KAPA Unique Dual-Indexed Adaptern durchgeführt und die Proben wurden gemäß dem Handbuch des Herstellers mit KAPA HiFi HotStart Ready Mix und sieben PCR-Amplifikationszyklen für das mit dem Adapter ligierte Produkt angereichert. Pools bestehend aus acht Probenbibliotheken wurden für die Hybrid-Capture-Virusanreicherung unter Verwendung des myBaits Expert Virus SARS-CoV-2-Panels und gemäß dem Herstellerhandbuch, Version 4.01, mit 14 Zyklen Post-Capture-PCR-Amplifikation (Arbor Biosciences) verwendet. Gereinigte, angereicherte Bibliotheken wurden mit dem Kapa Library Quantification Kit (Roche Sequencing Solutions) quantifiziert und als 2 × 150-Basenpaar-Reads auf dem Illumina NextSeq 550-Instrument (Illumina) sequenziert.

Rohe Fastq-Lesevorgänge wurden mit Cutadapt Version 1.1218 aus Illumina-Adaptersequenzen gekürzt und anschließend mit dem FASTX-Toolkit (Hannon Lab) auf Qualität gekürzt und gefiltert. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden mit Bowtie2 Version 2.2.919 und den Parametern --local --no-mixed -X 1500 auf das Genom von SARS-CoV-2 2019-nCoV/USA-WA1/2020 (MN985325.1) abgebildet. PCR-Duplikate wurden entfernt mit Picard MarkDuplicates (Broad Institute) und Varianten wurden mit GATK HaplotypeCaller Version 4.1.2.020 mit Parameter -ploidy 2 aufgerufen. Varianten wurden mit bcftools nach QUAL >1000 und DP >20 gefiltert.

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Softwareversion 8.2.1 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.

Alle in diesem Manuskript enthaltenen Daten wurden in Figshare (https://doi.org/10.35092/yhjc.12111570) hinterlegt. Sequenzen wurden im NCBI unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA632475 hinterlegt.

Lo, MK et al. GS-5734 und sein übergeordnetes Nukleosidanalogon hemmen Filo-, Pneumo- und Paramyxoviren. Wissenschaft. Rep. 7, 43395 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheahan, TP et al. Das antivirale Breitbandmittel GS-5734 hemmt sowohl epidemische als auch zoonotische Coronaviren. Wissenschaft. Übers. Med. 9, eaal3653 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

US National Library of Medicine Clinical Trials.gov (abgerufen am 15. Mai 2020); https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=remdesivir&cntry=&state=&city=&dist=

US-amerikanische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde. Update zum Coronavirus (COVID-19): FDA erteilt Notfallgenehmigung für potenzielle COVID-19-Behandlung https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-emergency -use-authorization-potential-covid-19-treatment (2020).

de Wit, E. et al. Prophylaktische und therapeutische Behandlung mit Remdesivir (GS-5734) im Rhesusaffen-Modell der MERS-CoV-Infektion. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 6771–6776 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheahan, TP et al. Vergleichende therapeutische Wirksamkeit von Remdesivir und der Kombination Lopinavir, Ritonavir und Interferon Beta gegen MERS-CoV. Nat. Komm. 11, 222 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choy, KT et al. Remdesivir, Lopinavir, Emetin und Homoharringtonin hemmen die SARS-CoV-2-Replikation in vitro. Antivirale Res. 178, 104786 (2020).