Ein Entwurf des Genoms von Escherichia coli aus dem 16. Jahrhundert, der mit einer opportunistischen Galleninfektion in Zusammenhang steht

Aug 09, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 599 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Escherichia coli – eines der am besten charakterisierten Bakterien und ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit – bleibt in der zeitlichen Landschaft unsichtbar. Hier präsentieren wir die sorgfältige Rekonstruktion des ersten antiken E. coli-Genoms aus einem Gallenstein aus dem 16. Jahrhundert einer italienischen Mumie mit chronischer Cholezystitis. Wir haben alte DNA isoliert und das alte E. coli-Genom rekonstruiert. Es bestand aus einem Chromosom mit 4446 Genen und zwei mutmaßlichen Plasmiden mit 52 Genen. Der E. coli-Stamm gehörte zur Phylogruppe A und einem außergewöhnlich seltenen Sequenztyp 4995. Die Gene der Typ-VI-Sekretionssystemkomponente scheinen horizontal von Klebsiella aerogenes erworben worden zu sein, wir konnten jedoch weder Pathovar-spezifische Gene noch erworbene Antibiotikaresistenzen identifizieren. Ein Sepsis-Maustest zeigte, dass ein eng verwandter zeitgenössischer E. coli-Stamm avirulent war. Unsere Rekonstruktion dieses alten E. coli trägt dazu bei, ein vollständigeres Bild der Belastung durch opportunistische Infektionen der Vergangenheit zu zeichnen.

Die Gewinnung antiker Krankheitserreger-DNA (aDNA) von menschlichen Opfern konzentrierte sich fast ausschließlich auf historisch bedeutsame Sterblichkeitsereignisse wie den Schwarzen Tod und enthüllte die Evolutionsgeschichte kanonischer Krankheitserreger wie Yersinia pestis, Mycobacterium tuberculosis1 und Variola-Virus. Im Gegensatz dazu ist ein Großteil der menschlichen Morbidität und Mortalität auf opportunistische Infektionen zurückzuführen, die in der Vergangenheit oft unsichtbar blieben. Opportunistische Krankheitserreger, also solche ohne historische Aufzeichnungen – wie Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus – wurden im Hinblick auf ihre gegenwärtigen Belastungen für den heutigen Menschen nur unzureichend untersucht2. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, in Zeiten von Stress, Ungleichgewicht oder Störung zu infizieren, während sie ansonsten kommensal oder saprophytisch sind3. Opportunistische Infektionen spielten in unserer gemeinsamen Vergangenheit wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der menschlichen Sterblichkeit und hatten daher weitreichendere Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit, als gemessen werden kann oder wurde.

Ein verwirrender Faktor bei der Identifizierung historisch wenig erforschter Krankheitserreger ist, dass die daraus resultierenden Infektionen wahrscheinlich in erster Linie opportunistisch waren. Das heißt, sie kolonisierten ihre Wirtsumgebung asymptomatisch, hinterließen keine erkennbaren Pathologien und sind daher in menschlichen Überresten nicht leicht zu identifizieren4. Antike DNA-Studien konzentrieren sich typischerweise auf obligatorische Krankheitserreger wie M. leprae, Salmonella enterica und Y. pestis, die leicht mit pathologisch eindeutigen oder historisch relevanten Mortalitätsereignissen in Verbindung gebracht werden können und daher in alten metagenomischen DNA-Lesedaten des Menschen leicht als fremd zu unterscheiden sind5, 6,7. Opportunistische Infektionen stellen aufgrund ihrer Allgegenwärtigkeit als Umweltkontaminanten und moderner Kommensalstämme die zusätzliche Belastung der Authentifizierung dar. Die historische Identifizierung dieser Krankheitserreger würde eine sorgfältige Bewertung ihrer Evolutionsgeschichte und des Kommensal-Pathogen-Kontinuums ermöglichen, das durch die Zunahme und den Verlust von Geninhalten definiert wird, wenn Stämme sich in Richtung der Virulenz des Wirts oder von dieser weg modulieren.

E. coli ist ein solcher Krankheitserreger. Es handelt sich um ein häufig vorkommendes Kommensalbakterium im Darmmikrobiom von Wirbeltieren8, das unter bestimmten Bedingungen auch zu einem opportunistischen Krankheitserreger werden kann9. E. coli hat so große Auswirkungen auf unsere Gesundheitssysteme, dass es Gegenstand mehrerer Impfstoffentwicklungsbemühungen ist, um die Auswirkungen der pathogensten Stämme abzuschwächen10. Da E. coli für mehrere Ausbrüche von Lebensmittelvergiftungen verantwortlich ist und sich zu einem der führenden Erreger von Todesfällen aufgrund antimikrobieller Resistenzen entwickelt hat, ist es ein Schlüsselbakterium, das bei der Überwachung der öffentlichen Gesundheit eingesetzt wird11.

Durch die weltweite Probenahme von E. coli-Stämmen entsteht ein Baum mit mehreren einzigartigen phylogenetischen Gruppen und eingestreuten Pathovaren12. Während die phylogenetischen Beziehungen zwischen Stämmen auf der Grundlage genetischer Ähnlichkeit konstruiert werden, werden Pathovare durch die Virulenzmerkmale ihrer Mitglieder definiert. In vielen Fällen gruppieren sich Mitglieder desselben Pathovars in derselben Klade. Da Virulenzgene jedoch horizontal erworben werden können, sind einige Pathovare – wie enteroaggregative E. coli – über mehrere phylogenetische Gruppen verteilt12. Diese bemerkenswerte Vielfalt und die evolutionären Übergangszustände unter E. coli-Stämmen unterstreichen ihre genomische Plastizität und evolutionäre Vielseitigkeit entlang dieses oben genannten Kontinuums. Alte E. coli-Genome würden nützliche Einblicke in die Kräfte liefern, die die Entstehung von Kommensalismus und Pathogenität bei Bakterien beeinflussen. Hier beschreiben wir die Rekonstruktion eines E. coli-Genoms aus dem 16. Jahrhundert, das aus dem Gallenstein eines italienischen Adligen – Giovanni d'Avalos (1538–1586) – charakterisiert wurde, wobei wir ein Genom mit kommensalen Merkmalen hervorheben.

Im Jahr 1983 wurden die mumifizierten Überreste mehrerer italienischer Adliger aus der Abtei des Heiligen Domenico Maggiore in Neapel, Italien, geborgen (ergänzende Abbildung 1). Eine sorgfältige paläopathologische und histologische Untersuchung einer der Personen – Giovani d'Avalos (NASD1), ein neapolitanischer Adliger, der 1586 im Alter von 48 Jahren starb (weitere Informationen finden Sie im Abschnitt „Ergänzende Anmerkungen“ der ergänzenden Materialien) – ergab das Ergebnis verdickte Gallenblasenwände, Rokitanski-Aschoff-Nebenhöhlen und mehrere intakte Gallensteine13. Diese Merkmale lassen darauf schließen, dass NASD1 möglicherweise an einer chronischen Cholezystitis gelitten hat14. Obwohl sie nicht die einzige Ursache für Cholezystitis sind, können chronische bakterielle Infektionen durch E. coli, Bacteroides spp. und Clostridium spp. kann zur Bildung von Gallensteinen führen15. Diese Infektionen werden typischerweise durch ein braunes Pigment angezeigt, wie es im Gallenstein von NASD115 zu sehen ist (Abb. 1a, b).

a Leber und Gallenblase von Giovani d'Avalos. Die Gallensteine ​​sind im roten Rechteck zu erkennen. Beachten Sie die dunkelbraune Färbung. Der Maßstabsbalken stellt eine 1 cm große Gallenblase mit verdickter Wand (a) und Rokitansky-Aschoff-Nebenhöhlen (b) dar (Hämatoxylin-Eosin, 3X und 250X). Der Maßstabsbalken für (a) entspricht 2 cm und für (b) 100 μm. c Schadensdiagramme der Enden \({5}^{\prime}\) und \({3}^{\prime}\) der zugeordneten Lesevorgänge für E. coli. Die Farben beziehen sich auf die Verdauung, nicht auf die Schadensart. Zur Berechnung der Schadensraten wurde Mapdamage 2.052 verwendet. d Fragmentlängenverteilung deduplizierter kartierter Lesevorgänge aus E. coli. Eine \({\log }_{10}\)-Skala wird verwendet, um die Unterschiede zwischen den Digests hervorzuheben. Damit ein Lesevorgang erhalten blieb, war eine Mindestlänge von 30 bp erforderlich.

Aus den DNA-Extrakten mit Kraken 216 erstellte metagenomische Profile lieferten vorläufige Beweise für das erhebliche und zunehmende Vorhandensein von Enterobacteriales in den Verdauungsrunden 2 (äußere Schicht), 3–4 (mittlere Schicht) und 5–6 (innere Schicht) des Gallensteins was darauf hinweist, dass NASD1 in den Gewebeproben nicht vorhanden ist (ergänzende Abbildung 2). Enterobacteriales-Ablesungen sind auch in Verdauungsrunde 1 vorhanden, sie sind jedoch mit denen in den Reagenzien-Blindproben vergleichbar (ergänzende Abbildung 2) und sind daher wahrscheinlich eine Mischung aus endogener und kontaminierender DNA wie Bradyrhizobium. Hinweise auf Artenebene ließen darauf schließen, dass E. coli den größten Anteil der als Enterobakterien identifizierten Messwerte ausmachte. Glücklicherweise sind E. coli-spezifische Messwerte in den Leerproben praktisch nicht vorhanden (≤ 0,002 %) und im zweiten bis sechsten Verdauungstest vorhanden. Im Vergleich dazu waren andere Taxa wie Alcaligenes und Bradyrhizobium sowohl in den Versuchsproben als auch in den Blindproben vorhanden und dürften Kontaminanten sein. Vom Menschen zugewiesene Lesevorgänge waren in allen Digests vorhanden, wurden aber auch in den Leerproben erkannt. Klebsiella aerogenes wurde ebenfalls nachgewiesen, allerdings nur in den Verdauungsrunden 3–4. Um die Authentizität der Messwerte von Mensch, E. coli und K. aerogenes zu beurteilen, untersuchten wir die Desaminierungs- und Depurinierungskinetik (Abb. 1c, d und ergänzende Abb. 3).

Das rekonstruierte alte E. coli-Genom hatte eine mittlere Lesetiefe von 28,46[28,31, 28,62] ×, eine mittlere Heterozygotie von 7,66 × 10−4[6,66 × 10−4, 8,66 × 10−4], 4446 Gene bei der Kartierung auf das E. coli-Genom . coli-Pangenomdatensatz und eine geschätzte Gesamtgröße von 4050, 429 bp, wenn die erkannten Gene verkettet werden. Signifikante Unterschiede (zweiseitiger t-Test, P = 7,951 × 10−05) wurden beim Vergleich der Lesetiefen des Kerns (3122 Gene, 28,73[28,61, 28,86] ×) und der akzessorischen Gene (1324 Gene, 27,82[27,39, 28,26]) festgestellt. ×) Genome (Abb. 2a und Tabelle 1); Das Gleiche galt für ihre mittlere Heterozygotie mit einem Kern von 2,74 × 10–4 [2,34 × 10–4, 3,15 × 10–4] und einem akzessorischen Genom von 1,92 × 10–3 [1,61 × 10–3, 2,24 × 10– 3](Ergänzende Abbildung 4). Es wurde festgestellt, dass 83 Gene eine wesentlich (mindestens zwei Standardabweichungen) tiefere Genabdeckung aufweisen. Diese Ergebnisse wurden dann mit den eng verwandten A-Phylogruppe-E.-coli-Genomen von FSIS11816402, einem Sequenztyp (ST) 4995-Stamm, und K-12 MG1655, einem ST10-Stamm, verglichen (Abb. 2b und ergänzende Abb. 5). Beide Genomvergleiche ergaben eine geringere mittlere Tiefe mit einer größeren Abdeckungsvarianz. Dies gilt insbesondere für FSIS11816402, da 25,24 % seiner Contigs eine durchschnittliche Abdeckung von weniger als 1 × aufwiesen (ergänzende Abbildung 6).

a Verteilung der mittleren Genabdeckungen mit einem CV ≤1 für das alte Genom. Die gestrichelte Linie zeigt die Erkennungsschwelle bei 10× an. Das schwarze Rechteck auf der rechten Seite zeigt den Bereich an, in dem sich Gene mit einer hohen Kopienzahl befinden (definiert durch \(\bar{x}+2* s\)). b Abdeckungsdiagramm für FSIS11816402. Zur Veranschaulichung wurde ein Fenster von 1 % verwendet. c Abdeckungsdiagramm für CP019906.1. Zur Veranschaulichung wurde ein Fenster von 0,1 % verwendet. Die erste Spur zeigt die Abdeckung an, wobei die rote Linie den Gesamtmittelwert darstellt. Die zweite Spur gibt die Anzahl der SNPs im selben Fenster an, während die dritte Spur den GC-Inhalt darstellt. d Genabdeckung des T6SS in K. aerogenes unter Verwendung eines 100-bp-Fensters. Gennamen sind enthalten, sofern verfügbar.

Wir haben mit MOB-suite17 zwei potenzielle Plasmide innerhalb der zusammengesetzten Gerüste identifiziert: E. coli MDR_56-Plasmid ohne Namen 5 (CP019906.1) und S. flexneri 1a-Stamm 0228-Plasmide (CP012732.1). Nachfolgende Kartierungen der E. coli-Rücklesungen auf diese Referenzplasmide bestätigten deren Vorhandensein im alten Stamm und authentifizierten ihren Ursprung (Abb. 2c und ergänzende Abb. 5, 7). Ein Plasmid, CP019906.1, hatte eine ähnliche Leseabdeckung wie K-12 (20,95[20,80, 21,10] ×) und 34 Gene, während CP012732.1 eine geringere Abdeckung (16,46[16,28, 16,64] ×) und nur 19 aufwies Gene. Diese Plasmide enthalten Regionen ohne Leseabdeckung – einschließlich einer Region mit ca. 6,6 Kbp in CP012732.1 – wir konnten jedoch nicht bestätigen, ob die Gene Teil des Chromosoms waren.

Eine Teilmenge der sequenzierten Lesevorgänge wurde von Kraken 216 auch als zu K. aerogenes gehörend klassifiziert. Um dieses Ergebnis zu bestätigen oder zu widerlegen, wurden nicht kartierte Lesevorgänge mit dem Referenzgenom von K. aerogenes (NC_015663.1) abgeglichen. Die Gesamtlesetiefe (0,38[0,37, 0,38] ×) und die Genomabdeckung waren gering (3,43 %), was darauf hindeutet, dass nur eine Teilmenge der Gene von K. aeorgenes vorhanden war. Ein 38-Kbp-Abschnitt des Genoms (Abb. 2d) hatte jedoch eine Read-Mapping-Tiefe ähnlich den alten E. coli-Ergebnissen (20,36[20,23, 20,50] ×).

Um den alten E. coli in die globale Phylogenie einzuordnen und zur Identifizierung des Stamms beizutragen, haben wir ein Kern-SNP-Alignment von 451 E. coli- und vier Shigella-Genomen erstellt, das die aktuelle Breite der E. coli-Diversität repräsentiert. Nach Entfernen der Redundanz enthielt die resultierende Phylogenie 107 Genome. Dieser beschnittene Probensatz wurde dann verwendet, um eine neue Ausrichtung von 5007 Kern-SNPs zu erstellen, die eine Gesamttopologie ergab, die zuvor veröffentlichten Ergebnissen ähnelte, und den alten Stamm in eine stark unterstützte Phylogenie innerhalb der Phylogruppe A einordnete (Abb. 3a).

a Die globale Phylogenie mit Bootstrap-Werten und phylogenetischen Gruppen mit E. coli EC42405 als Außengruppe. b Phylogenie der reduzierten Untergruppe A0 gemäß Definition durch den Clermont-Genotyp (+ - - -)61. Spitzenpunkte repräsentieren den Sequenztyp der Belastung. IAI1 war die Außengruppe der Phylogenie. c Phylogenie der ST4995-Stämme. Rote Rechtecke stellen das 95 %-Konfidenzintervall für die Topologie dar; Beschriftungen geben das mittlere Datum der Divergenz an. Die Evolutionsrate für die Phylogenie betrug 2,555 × 10–6[1,567 × 10–6, 3,992 × 10–6] Subs/Standort/Jahr. CFSAN051544 war die Außengruppe. Die braunen Pfeile zeigen die Position des alten Genoms an.

Um die Position des alten Stamms innerhalb der Gruppe A genauer zu verfeinern, haben wir einen reduzierten ML-Baum mit 94 Genomen (Abb. 3b) erstellt, die aus 291 SNPs bestehen. Das alte Genom war mit einer gewissen statistischen Unterstützung (Bootstrap-Unterstützung von 65 %) eng mit den ST4995-Stämmen verbunden, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich Teil desselben Sequenztyps ist (Tabelle 2). Anschließend wurde unter Verwendung der 22 verfügbaren ST4995-Genome von Enterobase18 ein noch weiter verfeinerter ML-Baum generiert (Abb. 3c). Das Kern-SNP-Alignment enthielt 16.026 Nukleotide und bot eine viel höhere Auflösung als die globalen und A0-Untergruppen-Alignments. Der alte Stamm gruppiert sich eindeutig innerhalb des ST4995-Genoms.

Wir suchten mit TEMPest19 nach zeitlichen Signalen in allen Phylogenien und fanden eines, als die Phylogenie auf die ST4995-Genome beschränkt war (ergänzende Abbildung 8). Ein Ergebnis bestätigte einen Datums-Randomisierungstest bei LSD (P = 0,003). Die ST4995-Phylogenie (Abb. 3c) lässt auf ein tMCRA aus dem 11. Jahrhundert (1027[787, 1220] n. Chr.) für ST4995-Stämme schließen, fast 500 Jahre vor der Diversifizierung der modernen Stämme. Die geschätzte Evolutionsrate über die gesamte Phylogenie betrug 2,555 × 10–6[1,567 × 10–6, 3,992 × 10–6] Subs/Standort/Jahr, ähnlich wie zuvor veröffentlichte Ergebnisse20.

Die Multilocus-Sequenzierung und Typisierung unseres alten E. coli-Genoms bestätigte seine Platzierung im ST4995 – einem seltenen Sequenztyp mit nur 22 Stämmen in der Enterobase18-Datenbank, die 182.476 Einträge18 umfasst. Es zeigte ein Onovel15:H? Serotyp, ähnlich seinen Schwestertaxa (vollständige Ergebnisse finden Sie im Abschnitt „Ergänzende Diskussion“ in den ergänzenden Materialien). Eine andere fimH-Variante – fimH86 – war in unserem E. coli-Stamm vorhanden.

Die Mehrheit (95 %) der E. coli-Stämme enthielt 3190 Kerngene, von denen 3122 in unserem alten Genom nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung 9). Die Anreicherungsanalyse der fehlenden Kerngene ergab einen signifikanten Mangel an Flagellenassemblierungsgenen (P = 0,0445), das Protein-Protein-Netzwerk enthielt jedoch die erwartete Anzahl an Interaktionen (P = 0,11). Eine Analyse von Regionen mit kartierten alten Lesevorgängen in CP019906.1 ergab das Vorhandensein von Genen, die an der Biofilmbildung (NP_311382.1) beteiligt sind, und einer Multidrug-Efflux-Pumpe (acrD). Im Gegensatz dazu stehen bei CP012732.1 die auf Pseudogene abgebildeten Lesevorgänge wahrscheinlich im Zusammenhang mit Osmoprotektions- und Transkriptionsvorschriften.

Eine Anwesenheits-/Abwesenheitsanalyse (P/A) des akzessorischen Genoms fasst die Ergebnisse der ML-Phylogenie-Ergebnisse (Abb. 4a) und zuvor veröffentlichter Ergebnisse zusammen21. Das akzessorische PCoA weist darauf hin, dass das Genom Mitglied der Phylogruppe A und ein angestammtes Mitglied von ST4995 ist. Letzteres wird durch eine P/A-Analyse eines reinen ST4995-Pan-Genoms bestätigt (ergänzende Abbildung 10).

Das akzessorische Genom (a, c) und die identifizierten Virulenzgene (b, d) wurden unter Verwendung einer binären Distanz geclustert. Phylogruppen wurden mithilfe von Clermont Typing59 identifiziert, während Pathovare mithilfe verfügbarer Metadaten aus der Patric49-Datenbank bestimmt wurden. Das alte Genom ist durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. In beiden binären Abständen wurden vor der Erstellung des PCoA berechnet.

Im alten Genom wurden insgesamt 91 Virulenzfaktoren identifiziert, von denen 37 in E. coli K-12 MG1655 nicht gefunden wurden (siehe Tabelle 3 für Genfamilien mit mehr als einem Treffer). Die Komponenten des Typ-VI-Sekretionssystems (T6SS) bestanden aus der Mehrzahl dieser Gene und enthielten hohe Kopienzahlen. Das T6SS – gebildet von der tss-Genfamilie sowie hcp, vasK und vgrG – vermittelt antagonistische Interaktionen zwischen konkurrierenden Bakterien. Zusätzlich zu seiner Rolle bei der Abtötung von Bakterien ist T6SS an der interbakteriellen Signalübertragung, der Biofilmbildung und der Phagenabwehr beteiligt22. Auch Teile eines Typ-III-Sekretionssystems wurden in deutlich geringeren Konzentrationen nachgewiesen.

Wir beobachteten auch unvollständige Komplemente von Virulenzgenen, die an mehreren Mechanismen beteiligt sind. Im antiken Genom wurden mehrere Gene gefunden, die zu den Familien ecp und fim fimbriae gehören. Sie sind zwar an der Virulenz beteiligt9,23,24, können aber auch in kommensalen Stämmen vorkommen. Fimbrien, von denen bekannt ist, dass sie mit Virulenz assoziiert sind, wie cfaB und csg, wurden ebenfalls identifiziert23, sie liefern jedoch nicht genügend Informationen, um das spezifische Pathovar des alten Stammes zu bestimmen9,23,24. Die wichtigsten Virulenzfaktoren für die E. coli-Pathovare wie eae und stx für Shiga-Toxin produzierende E. coli (STEC), hitzelabile und hitzestabile Gene für enterotoxigene E. coli (ETEC) und das Typ-III-Sekretionssystem in EPEC und EHEC fehlten9.

Im Gegensatz dazu wurde astA, ein wichtiger Virulenzfaktor in enteroaggregativen E. coli (EAEC)25, im alten Genom nachgewiesen. In Kombination mit dem Nachweis, dass T6SS häufig in EAEC-Stämmen vorkommt9, könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass der alte Stamm ein Mitglied dieses Pathovars war. Die verbleibenden EAEC-Virulenzfaktoren im Pan-Genom – aggA, aggR und aap – wurden jedoch nicht nachgewiesen25. Das alte Genom enthält außerdem ein vollständiges Enterobactin-System, das für die Eisenaufnahme verantwortlich ist23. Das Enterobactin-System und das astA-Gen wurden auch in E. coli K-12 MG1655 gefunden, was erneut darauf hindeutet, dass sie allein nicht genügend Virulenz verleihen.

Um das extraintestinale Virulenzpotenzial von ST4995 zu bewerten, haben wir einen nahen Verwandten (507 Kern-SNPs, die die beiden Stämme trennen) des alten Genoms, den Referenzstamm ATCC11229 (Ähnlichkeiten mit dem modernen Stamm siehe Abb. 3b und ergänzende Abb. 11), getestet Gut kalibrierter Maus-Sepsis-Assay, bei dem zehn Mäuse mit dem Stamm geimpft und ihr Tod aufgezeichnet wurde26. Keine der Mäuse wurde durch ATCC11229 getötet, wohingegen alle Mäuse, die mit dem Positivkontrollstamm B2 der Phylogruppe CFT073 infiziert waren, getötet wurden. Der Phänotyp des Stammes, der die Mäuse tötete, hängt mit dem Vorhandensein spezifischer extraintestinaler Virulenzgene zusammen, die eine wichtige Rolle im Eiseneinfangsystem spielen und für Gene kodieren, die beispielsweise auf der Insel der hohen Pathogenität (High Pathogenicity Island, HPI) kodieren27,28. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem Fehlen typischer extraintestinaler Virulenzgene im ATCC11229 und im alten Stamm.

Wir durchsuchten unser altes Genom mithilfe des Resistance Gene Identifier29 nach antimikrobiellen Resistenzgenen (AMR) und fanden 47 verschiedene Gene im Gerüstaufbau unseres alten E. coli-Genoms. Davon wurden 35 Gene auch in der globalen Pan-Genom-P/A-Analyse identifiziert. Acht Gene enthielten Duplikate, wobei mdtB am häufigsten nachgewiesen wurde. Die verbleibende Untergruppe umfasste dreizehn antimikrobielle Arzneimittelresistenzklassen, wobei neun Klassen mehr als einmal vertreten waren (Tabelle 4). Im alten E. coli-Stamm wurden Resistenzkassetten entdeckt, die auf die fünf häufigsten Arzneimittelklassen abzielen. Bei den meisten dieser Gene handelt es sich um Multidrug-Efflux-Pumpen, was typisch für E. coli ist30. In unserem alten Genom waren keine unerwarteten AMR-Gene vorhanden, alle 35 wurden in E. coli K-12 MG1655 gefunden.

Die aus dem Stein isolierte DNA zeigte eindeutige Hinweise auf DNA-Schäden. Insbesondere enthielten die Desaminierungsdiagramme für die Zuordnung alter Lesevorgänge zur E. coli-Pangenom-Referenz charakteristische aDNA-Profile, die auf erhöhte Desaminierungsraten an oder in der Nähe der terminalen Basen hindeuteten (Abb. 1c). Darüber hinaus zeigten Depurinierungskinetikdiagramme der E. coli-kartierten Lesevorgänge aus Bibliotheken mit ausreichender E. coli-Lesetiefe (Verdaus 2, 3–4, 5–6), dass Fragmente aus inneren Abschnitten des Gallensteins (besser geschützt vor Hydrolyse) vorhanden waren durchschnittlich länger (34 bp Median in Verdauung 2 bis 37 bp Median in Verdauung 5–6) (Abb. 1d). Wir haben ähnliche Ergebnisse für die K. aerogenes-Daten in den Verdauungen zwei bis sechs erhalten. Interessanterweise fehlen den kartierten menschlichen Lesevorgängen diese Signaturmerkmale (ergänzende Abbildung 3). Noch wichtiger ist jedoch, dass sie bestätigen, dass die Sequenzen von E. coli und K. aerogenes tatsächlich uralt sind und nicht das Ergebnis einer modernen Kontamination waren.

Es gibt zwei mögliche Erklärungen für das Fehlen eines Desaminierungssignals in den kartierten menschlichen Lesevorgängen. Erstens enthält die Probe wahrscheinlich eine Mischung sowohl kontaminierender als auch in geringerem Maße authentischer alter menschlicher DNA. Dies ist mit ziemlicher Sicherheit beim ersten Aufschluss der Fall, da es sich um die äußere Schicht des Gallensteins handelt, die durch Handhabung, Lagerung, Probenahme usw. einer Kontamination ausgesetzt gewesen wäre. Vermutlich jedoch, als wir zu tieferen Schichten des Gallensteins vordrangen besser vor Kontamination geschützt war, überraschte das Fehlen endogener menschlicher DNA. Dies ist besonders auffällig bei den Bearbeitungsabständen für menschliche und E. coli-Werte aus den verschiedenen Verdauungen (ergänzende Abbildung 12). Die wahrscheinlichere Erklärung ist, dass es einfach nicht genügend menschliche DNA-Daten für eine aussagekräftige Schadensanalyse gibt. Gallensteine ​​entstehen typischerweise aus einer Kombination von Cholesterin, Gallensalzen und Phosphatidylcholin15. Darüber hinaus können in der stark sauren Umgebung der Gallenblase nur Bakterien gedeihen und möglicherweise einen Stein bilden, die auf das Überleben dieser Bedingungen spezialisiert sind15. Da Gallensteine ​​nicht aus direkten menschlichen Zellbestandteilen gebildet werden, ist ihr Inneres wahrscheinlich praktisch frei von menschlicher DNA, was sich stark von den Ergebnissen unterscheidet, die wir anhand der DNA antiker Abszesse erhalten haben31.

Die Ergebnisse der Gentiefe des alten E. coli-Genoms bestätigen das Fehlen moderner Kontaminanten, da sie Teil einer unimodalen Normalverteilung sind. Die einzige Ausnahme von diesen Abdeckungsstatistiken sind 83 Gene mit wesentlich größeren mittleren Tiefen (Supplemental Data 2). Diese Gene bestehen hauptsächlich aus hypothetischen Proteinen (24,10 %), Intergrases und Transposons (19,28 %) und dem T6SS (13,25 %). Sie enthalten auch eine deutlich (P = 5,03 × 10−11) größere mittlere Heterozygotie (1,23 × 10−2[9,25 × 10−3, 1,53 × 10−2]) als der Rest des antiken Genoms. Bei diesen Genen mit hoher Kopienzahl handelt es sich jedoch hauptsächlich um akzessorische Gene (96,34 %), was – in Kombination mit der größeren Heterozygotie und dem Vorhandensein von Transposons – darauf hindeutet, dass sie sich in mobilen Elementen befanden, die von mehreren Bakterienarten gemeinsam genutzt wurden.

Die Plasmide, die wir in der Gerüstbaugruppe entdeckten, CP019906.1 und CP012732.1, wiesen eine geringere Gentiefenabdeckung auf als die unseres rekonstruierten Chromosoms (Tabelle 1). Die meisten Plasmide sind typischerweise in größeren Kopienzahlen vorhanden als Chromosomen32. Dies war jedoch nicht der Fall, da das alte Chromosom eine signifikant tiefere mittlere Abdeckung aufwies (P = 0 unter Verwendung der Tukey-Methode zum Vergleich der Abdeckungsschätzungen zwischen den Plasmiden und dem alten Chromosom) als CP019906. 1 und CP012732.1. Eine Möglichkeit besteht darin, dass diese beiden Plasmide tatsächlich nicht vorhanden sind, sondern dass sich die Gene, auf die die alten Reads abgebildet wurden, tatsächlich im alten Chromosom befanden. Dies wird durch die Tatsache gestützt, dass die mittleren Gentiefen für die Plasmide genau innerhalb der Abdeckungsverteilung des Chromosoms liegen (Ergänzungstabelle 2). Dies könnte große Regionen der Plasmide erklären, in denen keine kartierten Reads vorhanden sind, sowie das Fehlen von Reads, die intergenen Regionen zugeordnet sind (siehe Abb. 2c und ergänzende Abb. 5B).

Die Zuordnung der Lesevorgänge zum Genom von K. aeorgenes könnte eine ähnliche Situation wie die Plasmiddaten darstellen. Interessanterweise hatte die 38-Kbp-Region im K. aerogenes-Chromosom eine ähnliche Lesetiefe, die sich jedoch erheblich von den Plasmiden und unterscheidet (P ≈ 0 unter Verwendung der Tukey-Methode zum Vergleich der Abdeckungsschätzungen zwischen dem K. aerogenes T6SS und dem alten E. coli-Chromosom). Das E. coli-Chromosom (20,36 ± 13,56 ×) enthält das Typ-VI-Sekretionssystem (T6SS), das bei gramnegativen Bakterien allgegenwärtig ist und eine wichtige Rolle bei antagonistischen Wechselwirkungen spielt22. Da T6SS unter Bakterien weit verbreitet ist, ist sein Vorkommen kein ausschließlicher Marker für K. aerogenes. Die kompetitive Lesekartierung zwischen E. coli und K. aerogenes legt jedoch nahe, dass dieses T6SS tatsächlich zu K. aerogenes und nicht zum homologen System in E. coli gehört, was auf einen kürzlich erfolgten horizontalen Transfer schließen lässt, der durch einen Vergleich ihrer relativen GC gestützt wird Inhalt33 (Ergänzende Abbildung 13).

Die Struktur unserer globalen Phylogenie ähnelt den zuvor veröffentlichten34 und ordnet das alte Genom mit sinnvoller Unterstützung in die Phylogruppe A ein (100 % Bootstrap für eine Gruppe von drei Stämmen). Interessanterweise wurden auch andere historische E. coli-Stämme (ca. 1800) in diese Phylogruppe eingeordnet35. Stämme, die von Menschen isoliert wurden, die in weniger industrialisierten und ländlicheren Gemeinden leben, beherbergen typischerweise Stämme, die zur Phylogruppe A8 gehören. Das spätmittelalterliche Datum unserer Probe sowie ihre phylogenetische Platzierung tragen zur Bestätigung ihrer Authentizität bei. Darüber hinaus zeigte eine Untersuchung von E. coli-Stämmen, die aus Galleninfektionen isoliert wurden, dass sie hauptsächlich zur phylogenetischen A-Gruppe gehören36.

Wir haben ein zeitliches Signal in der reduzierten Phylogenie identifiziert (Abb. 3c), das zusätzlichen Kontext für die Evolutionsgeschichte der ST4995-Stämme liefert. Der Großteil des Sequenztyps kann seine Abstammung auf einen Stamm aus dem Jahr etwa 1592[1479, 1690] n. Chr. zurückführen. Die Divergenz unseres alten Genoms und zweier anderer – ESC_AA9618AA_AS und ESC_VA4573AA_AS – hat jedoch eine tiefere tMRCA ca. 956[689, 1172] n. Chr. Angesichts der Altersunterschiede zwischen den beiden Gruppen ist es wahrscheinlich, dass ST4995 tatsächlich aus mindestens zwei Untergruppen besteht. Belege dafür finden sich in einem MDS der P/A-Analyse aller vorhandenen ST4995-Genome (ergänzende Abbildung 9).

Die P/A-Analyse der akzessorischen Gene fasst die Ergebnisse der ML-Phylogenien zusammen (Abb. 4a). Das zusätzliche PCoA bestätigt, dass der alte Stamm Mitglied der phylogenetischen Gruppe A ist, während eine anschließende P/A-Analyse mit einem reinen ST4995-Pan-Genom die Annahme stützt, dass das Genom Mitglied von ST4995 ist (ergänzende Abbildung 9). Die phylogenetische Gruppe A – die Gruppe, aus der ST4995 stammt – ist eine gut beschriebene Gruppe und der am häufigsten aus menschlichen Kommensalen isolierte Typ8. Die Vielfalt der E. coli-Stämme wird in erster Linie durch sozioökonomische Faktoren bestimmt, da Personen, die in modernen Industrieländern leben, eher Träger von B2-Stämmen sind, während Personen in weniger industrialisierten und ländlichen Gemeinden hauptsächlich A8-Stämme tragen. Angesichts der Zeitspanne, in der NASD1 lebte, ist unser altes E. coli Mitglied der phylogenetischen Gruppe A.

Im alten Genom wurden keine erworbenen AMR-Gene nachgewiesen, was das Alter des Stamms bestätigt. Nach der Entfernung der Multidrug-Effluxpumpen aus unserem Genom wurden im Vergleich zu E. coli K-12 MG165530 keine anderen AMR-Gene gefunden. Letzteres ist äußerst relevant, da eine starke Resistenz gegen eine bestimmte Arzneimittelklasse mehrere Mechanismen erfordert37. Daher ist es wahrscheinlich, dass nur leichte Resistenzen gegen diese antimikrobiellen Verbindungen erforderlich waren30,38.

Das identifizierte alte Genom wies wahrscheinlich kommensale Merkmale auf, da es die meisten seiner Virulenzfaktoren mit E. coli K-12 MG1655 teilt. Dem alten Stamm fehlen die kanonischen Virulenzfaktoren für STEC und ETEC, ihm fehlen aber auch die Komponenten des Typ-III-Sekretionssystems, das bei EHEC verwendet wird. Komponenten von EAEC – astA und T6SS9 – wurden nachgewiesen, andere wichtige Virulenzfaktoren fehlten jedoch und astA wurde auch in K-12 MG1655 nachgewiesen. Die Ergebnisse der P/A-Analyse der akzessorischen Gene mit Pathovar-Markierung (Abb. 4c) und der Virulenzgene (Abb. 4d) zeigen ein ähnliches Bild. Das alte Genom ist in einem relativ allgemeinen Cluster positioniert, der eine Vielzahl verschiedener Pathovare enthält, darunter EHEC, ETEC, ExPEC und STEC. Das Maus-Sepsis-Modell untermauert weiter, dass das alte Genom ein opportunistischer Krankheitserreger war, da der Proxy-Stamm – ATCC 11229 – keine Mäuse infizierte. Diese Informationen legen in Kombination mit den identifizierten Virulenzgenen und der P/A-Clusterbildung des alten E. coli nahe, dass das alte Genom ein opportunistischer Krankheitserreger ist, der während der Expansion in der Gallenblase eine K. aerogenes T6SS-Genkassette erworben hat, was mit früheren Arbeiten übereinstimmt Klebsiella sp. wird bei modernen Galleninfektionen häufig mit E. coli in Verbindung gebracht39.

Wir führten DNA-Extraktionen an einem einzelnen Gallenstein durch, der aus den mumifizierten Überresten von NASD1 isoliert worden war, in den Reinraumeinrichtungen des McMaster Ancient DNA Centre (McMaster University, Hamilton, Ontario, Kanada) und verwendeten dabei spezifische Methoden für antike DNA. Wir stellten die Hypothese auf, dass die aufeinanderfolgenden mineralisierten Schichten des Steins immer besser erhaltene DNA enthalten würden, und unterwarfen den Gallenstein daher sechs aufeinanderfolgenden Runden der Demineralisierung und Verdauung40. Anschließend wurde DNA aus 250 μl des Überstands aus jeder Runde extrahiert, die dann gereinigt und in doppelt indizierten Bibliotheken aufbereitet, nach Größe ausgewählt, um Artefakte zu entfernen, und auf der Illumina HiSeq 1500-Plattform mit 90 bp Paired-End-Reads sequenziert wurden41 ,42. Zu Vergleichszwecken wurden drei weitere Gewebetypen derselben Person (Blase, Dünndarm und Lunge) wie oben verarbeitet und sequenziert. Ausführliche Informationen zu den Methoden finden Sie im Abschnitt „Ergänzende Methoden“ in den ergänzenden Materialien.

Adapter wurden durch AdapterRemoval43 identifiziert, wobei das Trimmen und Zusammenführen von leeHom44 mithilfe seiner aDNA-Einstellung durchgeführt wurde. Die Sequenzierungsspuren wurden gegebenenfalls gepoolt und Kraken 216 bestimmte die gesamte metagenomische Zusammensetzung der Proben. Dies wurde durchgeführt, um das Metagenom zu charakterisieren und interessierende Taxa zu identifizieren. Es wurde eine Standard-Kraken-216-Datenbank mit einigen Modifikationen verwendet – eine Kmer-Größe von 25 bp und kein Minimierer –, um die kleineren Leselängen von aDNA-Fragmenten zu berücksichtigen. Die Lesevorgänge wurden vor der metagenomischen Analyse einer String-Deduplizierung mit prinseq45 unterzogen.

Die Proben wurden dann mit BWA47 mit einem maximalen Bearbeitungsabstand von 0,01 (-n 0,01), höchstens zwei Lückenöffnungen (-o 2) und effektiv deaktiviertem Seeding (-l 16500)48 gegen das menschliche Genom GRCh3846 kartiert. Damit ein Lesevorgang erfolgreich abgeglichen werden konnte, war eine Mindestlänge von 30 bp und eine Mapping-Qualität von 30 erforderlich. Fragmente, die nicht erfolgreich kartiert werden konnten, wurden dann mit den gleichen Einstellungen mit einem E. coli-Pangenom verglichen. Das Pan-Genom wurde mit E. coli-Genomen von PATRIC49 und vier Shigella-Genomen von NCBI erstellt. Insbesondere wurden Genome ausgewählt, die bei Menschen, Hühnern, Kühen, Hunden, Mäusen oder Schweinen gefunden wurden und bei denen festgestellt wurde, dass sie eine „gute“ Genomqualität (wie von PATRIC definiert) aufwiesen, was zu 451 Stämmen führte. Diese Sequenzen wurden mit Prokka50 annotiert, wobei die von NCBI erhaltenen Proteine ​​aus E. coli K-12 MG1655 (NC_000913.3) als vertrauenswürdige Sequenzen verwendet wurden. Die resultierenden Anmerkungen wurden von Roary51 zusammengestellt, um das Pan-Genom zu erstellen. Paralogs wurden nicht geteilt und als zusätzliche Einstellungen wurde eine BlastP-Identität von mindestens 90 % verwendet. Nicht erfolgreich kartierte menschliche Messwerte wurden auch mit K. aerogenes (NC_015663.1) verglichen, da dieser im Wesentlichen – proportionale Häufigkeit ≥ 1 % – in einem der Verdauungen vorhanden war, während er auch aus den Blindproben ausgeschlossen wurde.

Erfolgreich kartierte Lesevorgänge von Menschen, E. coli und K. aerogenes wurden basierend auf ihren \({5}^{\prime}\)- und \({3}^{\prime}\)-Koordinaten mit bam-rmdup (https.) dedupliziert ://bitbucket.org/ustenzel/biohazard-tools/src/master/). Die deduplizierten Proben wurden basierend auf ihrem Ursprungsverdau (1, 2, 3–4 oder 5–6) zusammengefasst. MapDamage 2.052 wurde verwendet, um das Ausmaß der Desaminierung über die zugeordneten Lesevorgänge abzuschätzen. Fragmentlängenverteilungen (FLD) und Zuordnungsfehlanpassungen wurden ebenfalls extrahiert. Die Heterozygotie wurde getestet, indem Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) mithilfe von bcftools aufgerufen wurden, wobei die Ploidie auf zwei53 und einen Qualitätsschwellenwert von 100 eingestellt war.

Nach der Authentifizierung wurde eine Assembly mit dem vollständigen Satz kartierter E. coli- und K. aerogenes-Lesevorgänge (d. h. nicht dedupliziert) unter Verwendung von SPAdes 3.14.1 im Isolationsmodus54 mit benutzerdefinierten kmer-Längen – 9, 19 und 29 – erstellt. Die resultierende Assembly war ein unvollständiges und stark fragmentiertes Gerüst. Dies war hauptsächlich auf die kurzen mittleren Fragmentlängen (35 bp) der Eingabe-Reads und die erforderlichen kmer-Größen zurückzuführen. Dennoch betrug die N50 der Anordnung 939 bp mit einer Gesamtlänge von 3.917.339 bp, was wesentlich kürzer ist als die vollständigen E. coli-Chromosomen in PATRIC (5,00[4,96, 5,05]Mbp). Die MOB-Suite wurde verwendet, um potenzielle Plasmide in der Anordnung zu identifizieren. Die endgültige Identifizierung erfolgte jedoch durch Kartierung auf die Referenzplasmide17.

Wir erstellten ein SNP-Alignment unter Verwendung der E. coli-Genome von PATRIC und der Shigella-Genome unter Verwendung von Snippy (https://github.com/tseemann/snippy) mit E. coli EC42405 (CP043414.1) als Referenzstamm. Nichtkanonische Basenpaare wurden durch ein N ersetzt und rekombinante Regionen wurden durch Gubbins entfernt55. Da das antike Genom mehrere Lücken enthielt, wurde die Markierung „filter_percentage“ auf 32 % erhöht, um sicherzustellen, dass die Assemblierung nicht ausgeschlossen wurde. Sobald Rekombinationsstellen identifiziert und entfernt wurden, wurde mithilfe von IQ-TREE 256 eine Maximum-Likelihood-Phylogenie erstellt. ModelFinder wurde verwendet, um das geeignete phylogenetische Modell mit Ermittlungsbias57 auszuwählen, und der Baum wurde 1000 Mal gebootstrappt. Redundante Genome wurden mit Treemmer aus der Phylogenie entfernt, um sicherzustellen, dass 95 % der Diversität – gemessen an der Wurzel-zu-Spitze-Länge – erhalten blieben, was 107 Genome ergab58. Mithilfe dieser beschnittenen Genome wurde dann eine neue SNP-Ausrichtung und Phylogenie erstellt. Die modernen Stämme wurden mithilfe von ClermonTyping59 anhand bekannter phylogenetischer Gruppen von E. coli markiert. Vier E. coli-Stämme, die als Teil von A identifiziert wurden, wurden als potenzielle Shigella-Stämme neu gekennzeichnet. Dies ist auf das Vorhandensein eines ipaH-Gens in zwei der Genomen und deren Positionierung in der Phylogenie zurückzuführen60.

Bei der Bestimmung der Phylogruppe des alten Genoms wurden die Genome der Untergruppe A0 von E. coli verwendet, um den alten Stamm sorgfältig innerhalb derselben Gruppe zu positionieren. Diese Untergruppe wird durch den Clermont-Genotyp (+ - - -)61 definiert. Weitere sieben enterotoxische E. coli-Stämme von Mentzer et al. 2014 wurden ebenfalls in die Phylogenie einbezogen62. Diese Phylogenie wurde mit dem gleichen zuvor beschriebenen Verfahren erstellt und mit IAI1 B1 (NC_011741.1) verwurzelt. Die Phylogenie der ST4995-Stämme wurde mit den 22 in Enterobase18 verfügbaren ST4995-Genomen erstellt und mit dem ST325-Stamm CFSAN051544 (SAMN05414627) verwurzelt. Um festzustellen, ob die Daten eine zeitliche Signatur enthielten, wurden der beschnittenen Phylogenie Probenahmedaten oder Sequenzierungsdaten zugewiesen und eine Wurzel-zu-Spitze-Regression (RTT) für die globale Phylogenie, die A0-Untergruppe und die ST4995-Phylogenie durchgeführt. Das Vorhandensein eines zeitlichen Signals wurde dann mithilfe eines Datums-Randomisierungstests und mit TEMPest19 bewertet. Mithilfe eines Datierungsansatzes der kleinsten Quadrate unter Verwendung von LSD263,64 wurde eine molekulare Uhr an die Daten angepasst.

Die datierte ST4995-Phylogenie wurde durch Datierung der Bootstrap-Bäume mit LSD2 erstellt (unter Verwendung von -rl ns 1500000 als Einstellungen)63. Diese Bäume wurden dann mit treeannotator65 zusammengefasst, wobei die Höhe der Knoten durch den Mittelwert der Bootstrap-Verteilung festgelegt wurde. Die resultierende Phylogenie wurde dann verwendet, um die datierte Phylogenie unter Einbeziehung der Knotenhöhen-Konfidenzintervalle darzustellen.

Um zu bestimmen, welche Gene im alten Stamm vorhanden waren, haben wir die Lesetiefen des alten E. coli-Pangenoms in eine Metrik für das Vorhandensein/Abwesenheit von Genen (P/A) umgewandelt. Anschließend verwendeten wir einen konservativen Ansatz und identifizierten ein Gen als vorhanden, wenn es eine durchschnittliche Sequenztiefe von mindestens 10 × mit einem Variationskoeffizienten (CV) ≤ 1 aufwies. Ein CV-Filter wurde verwendet, um Gene zu entfernen, die erhebliche Bereiche gestapelter Lesevorgänge enthielten. Im Vergleich zu einem Schwellenwert für die prozentuale Abdeckung ist ein CV bei nicht kartierten Bereichen freizügiger, wenn der Rest der Genabdeckung relativ konsistent ist. Ein zusätzlicher Schwellenwert von \(\bar{x}+2* s\) wurde verwendet, um Gene mit einer hohen Kopienzahl zu identifizieren. Obwohl diese Gene noch Teil des antiken Genoms sind, könnten sie möglicherweise zu Plasmiden32 gehören oder eine Genamplifikation darstellen66.

Die P/A-Matrix für moderne Stämme wurde von Roary51 erstellt. Ein 95-prozentiges Kerngenom der modernen Stämme wurde identifiziert und Gene, die in unserem alten Stamm fehlten, wurden an STRING67 übermittelt, um mithilfe eines Netzwerks, das aus Interaktionen mit „hohem Vertrauen“ besteht, funktionell annotiert zu werden. Virulenzfaktoren wurden mithilfe eines kuratierten Satzes bekannter Virulenzgene68 identifiziert. Mehrdeutig benannte Gene (z. B. Gruppe_1000) wurden vom 29.11.2019 über BlastX69 mit der nichtredundanten Proteindatenbank RefSeq mit einem maximalen E-Wert von 10−5 verglichen, um Kandidaten zu ermitteln. Wurden für ein Gen mehrere Treffer gefunden, wurde der kleinste E-Wert ausgewählt. Gleichstände wurden gelöst, indem das Gen mit dem höchsten Bitscore gefolgt von der höchsten prozentualen Identität ausgewählt wurde. Damit eine Übereinstimmung beibehalten und das mehrdeutige Gen umbenannt werden konnte, war eine Identität von mindestens 90 % erforderlich. Die Beschreibungen der bisher unklaren Gene wurden nach den Schlüsselwörtern „Sekretion, Invasion und Enterotoxin“ durchsucht. Gene mit Treffern aus dieser Suche wurden in die Virulenzgene einbezogen. Um das Pathovar des antiken Genoms zu bestimmen, wurden relevante Informationen aus den PATRIC-Metadaten extrahiert.

Wir führten eine P/A-Analyse des Kerngenoms, der akzessorischen Genome und der Virulenzgene durch. Die Stämme wurden in eine binäre Distanzmatrix umgewandelt und mithilfe einer PCoA geclustert. Um sicherzustellen, dass redundante Gene nicht einbezogen wurden, wurden zwei Ausschlusskriterien erstellt: Gene, die allgegenwärtig vorhanden waren, wurden ausgeschlossen und Gene, die nicht in mindestens fünf Genomen vorhanden waren, wurden aus der akzessorischen Genomanalyse entfernt. Von den 451 E. coli-Genomen wurden vier aufgrund geringer Genzahlen aus der Pan-Genom-Analyse entfernt (siehe ergänzende Abbildung 14 für Genzahlen und ergänzende Daten 1 für entfernte Genome). Der Resistance Gene Identifier (RGI)29 mit Standardeinstellungen identifizierte potenzielle antimikrobielle Resistenzen im alten Stamm. Es wurden nur RGI-Einträge akzeptiert, die aufgrund von Genhomologien zurückgegeben wurden und im Pan-Genom vorhanden waren. Sowohl die identifizierten Virulenz- als auch die Resistenzgene wurden mit dem archetypischen E. coli-Stamm K-12 MG1655 verglichen. Es ist avirulent und anfällig für Antibiotika70.

Zehn 14–16 g (4 Wochen alte) weibliche OF1-Mäuse von Charles River® (L'Arbresle, Frankreich) pro Stamm erhielten eine subkutane Injektion von 0,2 ml Bakteriensuspension in den Hals (2 × 108 koloniebildende Einheiten). . Die Zeit bis zum Tod wurde während der folgenden 7 Tage aufgezeichnet. Mäuse, die länger als 7 Tage überlebten, galten als geheilt und getötet. Der E. coli-Stamm CFT073 wurde als Positivkontrolle verwendet und tötete alle inokulierten Mäuse, wohingegen der E. coli-Stamm K-12 MG1655 als Negativkontrolle verwendet wurde, bei der alle inokulierten Mäuse überlebten26. Das Protokoll (n∘APAFIS#4948) wurde vom französischen Forschungsministerium und von der Ethikkommission für Tierversuche genehmigt. Der Stamm ATCC11229 (AMC 198) wurde aus der Sammlung des Institut Pasteur (CIP 103795) bezogen und das gesamte Genom mithilfe der Illumina-Technologie sequenziert, um die Identität des Stamms zu überprüfen. Dieser Stamm ist kommensalen Ursprungs und wird häufig für Bakterienresistenztests verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die rohen Sequenzierungsdaten wurden als PRJNA810725 mit unterstützenden Metadaten in der Ergänzungstabelle 1 auf NCBI hochgeladen. Der Zugriff auf die Probe selbst kann durch Kontaktaufnahme mit GSL arrangiert werden

Die Skripte und zusätzlichen Daten, die zur Analyse der Daten nach der Pan-Genom-Kartierung verwendet werden, sind unter https://github.com/longg2/AncientEcoli71 verfügbar. Die für die anfängliche Kartierung und die Erstellung des gesamten Genoms verwendeten Skripte sind unter https://github.com/longg2/LongBioinformatics/tree/vAncEcoli72 verfügbar.

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longg2. longg2/LongBioinformatics: alte Ecoli-Version. Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6403351 (2022).

Referenzen herunterladen

Wir danken Wael Elhenawy und Brian Coombes für ihre Korrespondenz sowie Sara Dion für ihre technische Unterstützung beim Mausmodell. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen SSHRC Insight Grant, Forschungsgelder aus dem Human- und Mikrobiomprogramm von CIFAR und dem Boris Family Fund an HP sowie durch den NSERC-Zuschuss RGPIN-2020-05733 an GBG unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise von unterstützt „Fondation pour la Recherche Médicale“ Equipe FRM 2016, Fördernummer DEQ20161136698 an ED

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: George S. Long, Jennifer Klunk.

Fachbereich Biologie, McMaster University, Hamilton, Kanada

George S. Long, Jennifer Klunk und G. Brian Golding

McMaster Ancient DNA Centre, Abteilungen für Anthropologie und Biochemie, McMaster University, Hamilton, Kanada

George S. Long, Jennifer Klunk, Ana T. Duggan, Madeline Tapson und Hendrik Poinar

Daicel Arbor Biosciences, 5840 Interface Drive, Suite 101, Ann Arbor, MI, 48103, USA

Jennifer Klunk und Madeline Tapson

Abteilung für Anthropologie, McMaster University, Hamilton, ON, Kanada

Ana T. Duggan

Abteilung für Paläopathologie, Abteilung für translationale Forschung und neue Technologien in Medizin und Chirurgie, Universität Pisa, Via Roma 57, 56126, Pisa, Italien

Valentina Giuffra

Institut für Humanwissenschaften (DISUM), Universität von Catania, Piazza Dante 32, 95124, Catania, Italien

Lavinia Gazze

Abteilung für Zivilisationen und Wissensformen, Universität Pisa, Via Trieste 40, 56126, Pisa, Italien

Antonio Fornaciari und Gino Fornaciari

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne, Melbourne, VIC, Australien

Sebastian Duchene

Universität Paris Cité, IAME, UMR 1137, INSERM, 75018, Paris, Frankreich

Olivier Clermont und Erick Denamur

Labor für Molekulargenetik, Bichat Hospital, APHP, 75018, Paris, Frankreich

Erick Denamur

Michael G. DeGroote Institute for Infectious Disease Research und CIFAR Humans and the Microbiome Program, Toronto, ON, Kanada

Hendrik Poinar

CIFAR Humans and the Microbiome Program, Toronto, ON, Kanada

Hendrik Poinar

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GSL und JK waren für die Untersuchung, Methodik, formale Analyse und den ursprünglichen Entwurf dieser Studie verantwortlich. GSL führte auch die Datenkuratierung durch. MT, ATD, VG, LG und AF unterstützten die Untersuchung. ATD trug auch zur Methodik bei. GF stellte die Probe zur Verfügung. ED und OC validierten die E. coli-Funktion und die Typisierungsergebnisse. ED stellte auch Mittel für den Maus-Sepsis-Assay bereit. SD validierte das zeitliche Signal und half bei seiner Untersuchung. GBG überwachte und stellte Rechenressourcen und Finanzmittel bereit. HP konzipierte und verwaltete das Projekt, stellte die Finanzierung bereit und betreute es auch. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit George S. Long, Erick Denamur oder Hendrik Poinar.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Luke R. Grinham. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Long, GS, Klunk, J., Duggan, AT et al. Ein Entwurf des Genoms von Escherichia coli aus dem 16. Jahrhundert, der mit einer opportunistischen Galleninfektion in Zusammenhang steht. Commun Biol 5, 599 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03527-1

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Eingegangen: 01. März 2022

Angenommen: 23. Mai 2022

Veröffentlicht: 16. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03527-1

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