Neue Ansätze zur Entwicklung von Biomarkern für den Einsatz hormoneller Kontrazeptiva

May 20, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 245 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Um Biomarker für die Verwendung hormoneller Kontrazeptiva (HC) im Urin und Speichel zu identifizieren, führten wir eine Pilotstudie mit 30 Frauen durch, die eine Behandlung mit kombinierten oralen Kontrazeptiva (COCs) mit Levonorgestrel (LNG) oder Depot-Medroxyprogesteronacetat (DMPA) einnahmen (15/Gruppe). Basierend auf der etablierten KOK-Pharmakokinetik haben wir Serum- und Urinproben vor der KOK-Einnahme und an den Tagen eins und drei der Anwendung oder vor der DMPA-Injektion und an den Tagen 21 und 60 nach der Injektion gesammelt. Wir verwendeten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), um LNG und MPA im Serum/Urin zu messen. LNG war zu Studienbeginn nicht nachweisbar (Spezifität 100 %); Nach der Einnahme wiesen die meisten Urinproben nachweisbare LNG-Werte auf (Sensitivität: 80 % 6 Stunden nach der ersten Dosis, 93 % 6 Stunden nach der dritten Dosis). Wir verwendeten ein DetectX LNG-Immunoassay-Kit und zeigten eine 100-prozentige Empfindlichkeit bei der Messung von Urin-LNG. Zu Studienbeginn waren bei 14/15 Frauen MPA-Werte im Urin nicht nachweisbar (Spezifität 91 %); Nach der Injektion wiesen alle Urinproben nachweisbare MPA-Werte auf (Sensitivität: 100 % an den Tagen 21 und 60). Die Ergebnisse legen nahe, dass Urinproben verwendet werden können, um einen Biomarker für die Verwendung von LNG und MPA zu identifizieren. Basierend auf Erkenntnissen aus anderen Studien zu Steroidhormonen, die Veränderungen zeigen, die sich auf das Transkriptomprofil des Speichels nach 24 Stunden auswirken, haben wir die gleichen Zeitpunkte (COC, DMPA) für die Speichelsammlung verwendet. Wir führten eine Transkriptomanalyse durch und entdeckten im Speichel von DMPA-Benutzern an den Tagen 21 und 60 im Vergleich zum Ausgangswert mehrere unterschiedlich exprimierte Gene; keine unter COC-Anwendern. Wir planen weitere Forschungen zur differenziellen Genexpression im Speichel als HC-Biomarker der DMPA-Verwendung und werden längere Zeiträume der COC-Verwendung und Speichelsammelzeiten sowie die Anwendung von microRNA-Sequenzierung untersuchen, um die Verwendung von Speichel als COC-Biomarker zu unterstützen.

Genaue Daten über den Einsatz von Verhütungsmitteln haben Auswirkungen auf die Festlegung öffentlicher Gesundheitsziele, die Bereitstellung klinischer Versorgung und die Durchführung klinischer Forschung. Im Bereich der öffentlichen Gesundheit wirken sich Statistiken über die Prävalenzraten von Verhütungsmitteln (CPR) auf die Planung zur Erreichung realistischer nationaler und internationaler Ziele für sexuelle und reproduktive Gesundheitsdienste aus1,2,3. Die Genauigkeit der CPR-Daten ist besonders wichtig in Regionen, in denen die Schwangerschaftsraten trotz Berichten über eine hohe Rate an Verhütungsmitteln weiterhin hoch bleiben. Infolgedessen entspricht die Bereitstellung geburtshilflicher und neonataler klinischer Pflegedienste möglicherweise nicht den lokalen, regionalen oder nationalen Bedürfnissen4,5,6. Der Zugang zu Informationen über den Einsatz von Verhütungsmitteln kann auch die gemeinsame Entscheidungsfindung zwischen Ärzten und Klienten hinsichtlich der Auswahl einer Verhütungsmethode erleichtern, die am besten zum Erreichen individueller Familienplanungsziele geeignet ist7. Bei klinischen Studien bilden die von Freiwilligen erhobenen Daten über die Verwendung einer Methode die Grundlage für die Analyse und Berichterstattung über Sicherheits-, Wirksamkeits- und Akzeptanzergebnisse und sind von grundlegender Bedeutung für behördliche Überprüfungen und Entscheidungen über die Zulassung neuer Methoden8.

Angesichts der allgemeinen Bedeutung von Informationen zur Verwendung von Verhütungsmitteln haben zahlreiche Forscher über die anhaltenden Herausforderungen im Zusammenhang mit der Beschaffung genauer Daten auf der Grundlage von Selbstberichten nachgedacht7,8,9,10,11,12,13. Kürzlich haben mehrere Forscher ermutigendere Ergebnisse bei der Gewinnung genauer Daten beschrieben, empfehlen jedoch die Verwendung objektiver Maßnahmen zur Validierung der selbst gemeldeten Verwendung von Verhütungsmitteln14,15. Die Messung der Serumkonzentration von synthetischen Gestagenen (dem aktiven Bestandteil hormoneller Kontrazeptiva) in Proben gilt als „Goldstandard“16 für die Beurteilung der Verwendung hormoneller Kontrazeptiva (HC). Solche Tests erfordern jedoch invasive Venenpunktionen, sind auf Laboratorien angewiesen, die über spezielle Kapazitäten zur Bewertung exogener Hormonkonzentrationen verfügen, und sind für den Einsatz in Haushaltsbefragungen oder klinischen Studien im Spätstadium mit Tausenden von Teilnehmern unpraktisch. Es werden Untersuchungsansätze zur Messung des Hormonspiegels im Urin entwickelt, die jedoch tendenziell auf der Probenahme von endogenem Progesteron und Östrogen (wie Östradiol) im Rahmen der klinischen Versorgung basieren17. Wie gut beschrieben wurde, werden sowohl endogene als auch synthetische Steroidhormone hauptsächlich in der Leber metabolisiert und teilweise als konjugierte Metaboliten und intakte Hormone im Urin ausgeschieden. Wir gingen davon aus, dass wir gut beschriebene und hochempfindliche Methoden verwenden könnten, um diese Hormone oder ihre Metaboliten in Urinproben als Marker für den hormonellen Gebrauch zu messen17,18,19,20. Insbesondere haben wir spekuliert, dass wir validierte Methoden der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur Messung der LNG- und MPA-Werte in Blut- und Urinproben sowie das hochempfindliche LNG-Enzym-Immunoassay-Kit (DetectX; Arbor Assays, MI, USA) zur Messung von immunreaktivem LNG im Urin. Daher wollten wir herausfinden, ob Urin, der einfacher und kostengünstiger gesammelt werden kann als Serum, als objektiver Biomarker für häufig verwendete Kontrazeptiva mit Gestagenformulierung wie Levonorgestrel (LNG), das in vielen kombinierten oralen Kontrazeptiva enthalten ist, verwendet werden kann (COCs) oder Medroxyprogesteronacetat (MPA), das in injizierbaren Formulierungen verwendet wird, z. B. Depot-Medroxyprogesteronacetat (DMPA).

Wir haben auch über das Potenzial der Verwendung von Speichel zur Identifizierung von Biomarkern nachgedacht, da diese Körperflüssigkeit nicht nur ein Plasma-Ultrafiltrat ist, sondern auch eine ganze Bibliothek von Proteinen, Hormonen, Antikörpern und anderen molekularen Verbindungen enthält. Es ist eine ideale Matrix für die Anwendung der Transkriptomik zur Analyse der differentiellen Genexpression21. Wir haben die Theorie aufgestellt, dass synthetische Steroidhormone wie LNG und MPA durch passive Diffusion in den Speichel gelangen. Ihre erwarteten Konzentrationen sind jedoch im Vergleich zu Blut niedrig und können mit Methoden wie ELISA, die üblicherweise für Serum- und Urinproben angewendet werden, nicht zuverlässig gemessen werden. Wir gingen auch davon aus, dass sich bei der Anwendung hormoneller Verhütungsmittel das Transkriptomprofil im Speichel verändern würde und dass solche Veränderungen als potenzieller Biomarker für die Exposition gegenüber Verhütungsmitteln dienen könnten. Wir spekulierten, dass wir die RNA-Sequenzierung nutzen könnten, um differentiell exprimierte Gene (DEGs) in Speichelproben von Personen zu identifizieren, die hormonelle Verhütungsmittel anwenden22,23,24,25.

Dementsprechend haben wir eine offene Pilotstudie im Querschnitt durchgeführt, um festzustellen, ob wir validierte Tests verwenden können, um Hormone oder ihre Metaboliten in Urinproben von Personen zu messen, die KOK oder DMPA verwenden. Wir untersuchten auch die Machbarkeit der Verwendung von RNA-Sequenzierung mit Speichelproben zum Nachweis unterschiedlich exprimierter Gene als Marker für die Verwendung hormoneller Verhütungsmittel.

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Population Council, der Ethikkommission von Profamilia (Studienstandort) in der Dominikanischen Republik und CONABIOS, der nationalen medizinischen Forschungsagentur der Dominikanischen Republik, genehmigt. Jeder Teilnehmer gab eine schriftliche Einverständniserklärung ab, bevor er sich einem Screening-Verfahren unterzog. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki, den Leitlinien der International Conference on Harmonisation Good Clinical Practice und dem US Code of Federal Regulations in Bezug auf klinische Studien durchgeführt.

Wir rekrutierten Frauen, die daran interessiert waren, für die Dauer der Studie mit DMPA oder KOK zu beginnen, und nahmen zwei Gruppen auf (15 pro Gruppe). Personen in Gruppe A verwendeten ein KOK, das Ethinylestradiol und LNG enthielt (EE: 30 µg und LNG 150 µg, Microgynon-Bayer, Deutschland), und Personen in Gruppe B verwendeten DMPA 150 mg (Pfizer Manufacturing Belgium NV, Belgien), das intramuskulär verabreicht wurde. Teilnahmeberechtigt waren gesunde, nicht schwangere und nicht stillende Erwachsene (18–39 Jahre), die derzeit kein DMPA verwenden und eine schriftliche Einverständniserklärung abgeben konnten. Wir haben potenzielle Teilnehmer ausgeschlossen, wenn sie derzeit oder in den zwei Monaten vor dem Screening an einer anderen Studie mit Verhütungsmitteln teilgenommen haben, Kontraindikationen für die Verwendung der ausgewählten Verhütungsmittel hatten, Vaginalblutungen hatten (ohne Schmierblutungen zwischen den Perioden) und positiv getestet wurden HIV- oder Hepatitis-B-Infektion beim Screening oder wenn in den letzten 12 Monaten DMPA eingenommen wurde. Eine vollständige Liste der Einschluss-/Ausschlusskriterien ist in der Ergänzungstabelle 1S aufgeführt.

Alle Teilnehmer hatten nach dem Screening drei Besuche; Der Zeitrahmen für die Entnahme von Serum-, Urin- und Speichelproben variierte je nach Gruppe/Verhütungsmethode (Tabelle 1). Die Teilnehmer der Gruppe A nahmen ihre erste, zweite und dritte Pille am Studienort ein. Vor der ersten Dosis und in festgelegten Abständen an den Tagen 1 und 3 wurden ihnen Serum, Urin und Speichel entnommen. Den Teilnehmern der Gruppe B wurden vor der ersten DMPA-Injektion am ersten Tag und noch einmal Serum-, Urin- und Speichelproben entnommen an den Tagen 21 und 60 (± 4 Tage). Das Personal vor Ort überwachte die Teilnehmer während der gesamten Studie auf das Auftreten unerwünschter Ereignisse (AEs) und schwerwiegender unerwünschter Ereignisse (SAEs). Die Daten der Teilnehmer wurden in allen Studiendokumenten, Proben, Analysen und nachfolgenden Berechnungen anonymisiert.

Wir haben Zeitpunkte für die Entnahme von Urin- und Serumproben von KOK-Anwendern auf der Grundlage der etablierten Pharmakokinetik (PK) von KOK ausgewählt, die tägliche Höchst- und Tiefstkonzentrationen von Gestagen mit sich bringen und für jeden 24-Stunden-Zeitraum während der Zyklustage, an denen die Pille eingenommen wird, gleich sind zur Unterdrückung des Eisprungs26. Die maximale Serumkonzentration von oral verabreichtem LNG liegt im Allgemeinen etwa ein bis zwei Stunden nach der Einnahme, und seine Metaboliten erscheinen zusammen mit kleinen Mengen an nicht metabolisiertem LNG etwa vier bis acht Stunden nach der Einnahme im Urin. Daher wählten wir einen sechsstündigen Zeitpunkt für die Sammlung von Serum und Urin nach der KOK-Einnahme und wählten die Tage 1 und 3 für die Probenentnahme (Tabelle 1).

Wir haben auch etablierte PK-Daten verwendet, um Zeitpunkte für die Serum- und Urinsammlung für DMPA-Anwender auszuwählen27. MPA wird langsam von der DMPA-Injektionsstelle ins Blut freigesetzt und der Spiegel wird aufrechterhalten, um eine Unterdrückung des Eisprungs (Wirksamkeit) für mindestens drei Monate zu erreichen. Ab Tag 3 nach der Injektion erscheinen geringe Mengen nicht metabolisierter MPA und ihrer Metaboliten im Steady-State im Urin und können über die längere Behandlungsdauer zuverlässig gemessen werden. Die maximale MPA-Konzentration wird im Serum im Allgemeinen etwa drei Wochen nach der Injektion gefunden und die Werte werden aufrechterhalten, um eine Wirksamkeit für mindestens drei Monate zu erreichen. Daher haben wir am 21. Tag Serum von DMPA-Anwendern gesammelt und Tag 60 für die zweite Sammlung ausgewählt (Tabelle 1).

In Bezug auf Speichel bestand das Ziel darin, die Auswirkungen auf das Transkriptomprofil von Speichel als Reaktion auf die Verwendung und Konzentration von LNG und MPA im Serum zu ermitteln. Da Speichel ein guter Indikator für den Plasmaspiegel verschiedener Substanzen wie Hormone und Pharmazeutika ist und Speichel-mRNA als chemische Signatur dafür dient, dass ein bestimmtes Gen exprimiert wurde21, gingen wir davon aus, dass wir dieselben Zeitpunkte verwenden könnten, die wir für die Serumentnahme ausgewählt hatten und Urin zum Sammeln von Speichel (Tabelle 1). Bei der Auswahl dieser Zeitpunkte ließen wir uns auch von Erkenntnissen aus Studien beeinflussen, die andere Steroidhormone untersuchten. Bei Testosteron beispielsweise stellten Forscher bei transdermaler Verabreichung einen signifikanten Anstieg des Testosteronspiegels im Speichel, Blut und Urin fest28.

Serum Ein Phlebotomiker sammelte 10 ml Blut pro Teilnehmer, das zu Serum verarbeitet, sofort eingefroren und bei –20 °C gelagert wurde, bis es zur Analyse auf Trockeneis an den Population Council in New York geschickt wurde.

Urin Wir stellten den Teilnehmern Probenahmebehälter zur Verfügung, um zu bestimmten Zeitpunkten 20–30 ml Urin zu sammeln. Diese wurden bis zum Versand bei –20 °C aufbewahrt.

Das Personal der Speichelstelle wies die Teilnehmer an, mindestens eine Stunde vor der Probenahme auf Essen, Trinken, Rauchen oder Mundhygienemaßnahmen zu verzichten und über einen Zeitraum von 5 Minuten Speichel in ein graduiertes Reagenzglas zu spucken, um etwa 5 ml Speichel zu sammeln. Um den RNA-Abbau zu verhindern, hielten die Mitarbeiter vor Ort die Sammelröhrchen vor dem Sammeln des Speichels auf Eis. In Übereinstimmung mit den Anweisungen des Lieferanten (Norgen Biotek, CA, USA) fügten die Mitarbeiter vor Ort unmittelbar nach der Entnahme 2 ml Konservierungsmittel mit einem Stabilisierungsreagenz hinzu und lagerten die Entnahmeröhrchen zur Vorbereitung für den Versand bei -80 °C.

Vor der Messung des Hormonspiegels in den Studienproben verwendeten wir unser Standardprotokoll gemäß den FDA-Richtlinien, um unsere LCMS-Methoden zur Messung von LNG und MPA in Serum und Urin zu validieren. Konkret haben wir sechs Konzentrationsstufen von Kalibrierungsstandards (STDs) im Bereich zwischen 0,1 und 10 ng/ml in menschlichem Serum angereichert und drei Stufen von Qualitätskontrollproben (QCs) separat mit Konzentrationen von 0,3, 1 und 7 ng/ml hergestellt. Wir verwendeten LNG-d6 bzw. MPA-d6 (5 ng/ml) als interne Standards (IS) und bewerteten und validierten die folgenden Parameter: Spezifität, Linearität, Quantifizierungsgrenze, Genauigkeit, Präzision, Matrixeffekte, Wiederfindung und Stabilität . Unsere Ergebnisse zeigten, dass wir die Akzeptanzkriterien aller Validierungsparameter gemäß dem Protokoll erfüllten.

Im nächsten Schritt haben wir die LNG- und MPA-Werte in Serum- und Urinproben mittels LC-MS/MS gemessen, wobei wir LNG-d6 bzw. MPA-d6 als interne Standards verwendeten. Um LNG oder MPA aus Serumtestproben zu reinigen, verwendeten wir die Proteinfällungsmethode. Konkret fügten wir 100 µl Methanol zu 100 µl der Testprobe hinzu, die IS (5 ng/ml) enthielt. Wir haben die Proben 15 Minuten lang gevortext (10 Minuten lang bei 14,5 × 103 U/min zentrifugiert) und die Überstände zur Injektion in Fläschchen mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) überführt. Darüber hinaus haben wir die LNG- oder MPA-Standards und die mit IS versetzten Qualitätskontrollproben mit der gleichen Proteinfällungsmethode verarbeitet.

Um LNG oder MPA aus Urinproben zu reinigen, führten wir eine Festphasenextraktion mit Oasis HLB Plus Light-Kartuschen (Waters Corporation, Milford, MA) durch. Wir haben LNG oder MPA mit 1 ml Methanol aus der Kartusche eluiert und jede Probe unter Stickstoffgas getrocknet. Wir haben das gereinigte LNG/MPA mit 150 µl mobiler Phase A/B (50/50, v/v) rekonstituiert und 10 µl-Aliquots in die Autoinjektorbaugruppe injiziert. Darüber hinaus verarbeiteten wir LNG- oder MPA-Standards, mit IS versetzte Qualitätskontrollproben und 1 ml leeren menschlichen Urin mit der gleichen Festphasenextraktionsmethode. Wir verwendeten die UPLC BEH C18-Säule (1,7 µm, 2,1 × 50 mm) von Waters Acquity, um LNG oder MPA von anderen Komponenten durch Gradientenelution unter Verwendung der mobilen Phase aus 80 % A (2 mM Ammoniumformiat + 0,1 % Ameisensäure in 10 % Methanol) zu trennen ) und 20 % B (100 % Methanol) bis zu 6 Minuten auf 90 % B mit einer Durchflussrate von 0,3 ml/min. Anschließend verwendeten wir Waters TQ-s, um die Produktion-Ionen-Übergänge von 313,35 m/z bis 245,28 m/z für LNG und 319,38 bis 251,32 m/z für LNG-d6 IS zu überwachen. In ähnlicher Weise haben wir die Übergänge von 387,42 m/z bis 327,35 m/z für MPA und 393,40 m/z bis 330,34 m/z für MPA-d6 IS überwacht. Wir haben die MassLynx-Softwareversion 4.2 verwendet, um alle Parameter des LC-MS/MS-Systems zu steuern.

Bei der Analyse der Studienproben haben wir sechs Niveaus an Kalibrierungsstandards, einen Doppelblindwert, einen mit internem Standard versetzten Matrixblindwert und drei Niveaus an Qualitätskontrollproben (n = 2) einbezogen. Wir haben einen Satz Qualitätskontrollproben vor die Probenwarteschlange gestellt und einen weiteren Satz am Ende der Probenwarteschlange. Die Kalibrierungsstandards wurden vorne injiziert und am Ende der Probenwarteschlange wieder injiziert. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ) für Serum-LNG und MPA betrug 0,1 ng/ml und für Urin-LNG und MPA 25 pg/ml. 50 µl der Serumprobe wurden für LNG oder MPA im Serumtest verwendet und eine 1 ml menschliche Urinprobe wurde für LNG oder MPA im Urintest verwendet. Basierend auf den Ergebnissen der Qualitätskontrollproben betrug der Intra- und Inter-Assay-Variationskoeffizient weniger als 15 %.

Wir haben ein kommerzielles DetectX LNG EIA-Kit (Arbor Assays, MI, USA) verwendet, um LNG und Metaboliten in Serum- und Urinproben zu messen. Um den Assay zu validieren, haben wir zunächst die LNG-Werte in Serumproben gemessen und sie mit den durch LC-MS/MS erhaltenen Werten verglichen. Als nächstes optimierten wir die Messung des LNG-Gehalts in den Urinproben, die durch die gleiche Festphasenextraktion gereinigt wurden, die für LC-MS/MS-Messverfahren beschrieben wurde. Wir haben getrocknete Rückstände mit einem Testpuffer rekonstituiert und das Immunoassay-Kit-Verfahren zur Messung der LNG-Konzentrationen verwendet. Wir haben die LNG-Werte im Urin als pg/ml angegeben; die untere Nachweisgrenze lag bei 80 pg/ml.

Um die Gesamt-RNA aus dem Speichel jedes Teilnehmers zu extrahieren, verwendeten wir TRIzol®-Lysepuffer und reinigten diese RNA dann mit einem Nucleospin-RNA-Extraktionskit (Takara Bio, CA, USA, Inc.). Wir haben die RNA-Konzentrationen mit dem Qubit Fluorometer (Life Technologies, MA, USA) und die RNA-Integrität mit dem Bioanalysator (Agilent 4200 Tape Station) gemessen. Wir führten RNA-Bibliotheksvorbereitungen für Sequenzierungsreaktionen durch. Anschließend haben wir die RNA markiert und mit dem Total RNA-Seq-Kit sequenziert. Wir verwendeten das SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit für die Sequenzierung für die cDNA-Synthese und -Amplifikation in voller Länge (Clontech, CA, USA) und die Illumina Nextera XT-Bibliothek für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek. Kurz gesagt, die cDNA wurde fragmentiert und der Adapter mithilfe von Transposase hinzugefügt, gefolgt von einer PCR mit begrenztem Zyklus, um die cDNA-Fragmente anzureichern und einen Index hinzuzufügen. Die endgültige Bibliothek wurde mit Agilent TapeStation bewertet. Die Proben wurden unter Verwendung einer 2 × 150 Paired-End (PE)-Konfiguration sequenziert. Nutzung von Diensten von GENEWIZ, LLC. (South Plainfield, NJ, USA) führten wir die bioinformatische Analyse durch und verwendeten HiSeq Control Software (HCS), um Bildanalyse und Base Calling durchzuführen. Wir haben von Illumina HiSeq generierte Rohsequenzdaten (.bcl-Dateien) in Fastq-Dateien konvertiert und mit der bcl2fastq 2.17-Software von Illumina demultiplext. Zur Identifizierung der Indexsequenz wurde eine Nichtübereinstimmung zugelassen. Nach dem Demultiplexen überprüften wir die Sequenzdaten auf Gesamtqualität und Ausbeute. Anschließend haben wir mit Trimmomatic v.0.36 die Sequenzablesungen gekürzt, um mögliche Adaptersequenzen und Nukleotide mit schlechter Qualität zu entfernen. Wir haben die getrimmten Lesevorgänge dem auf ENSEMBL verfügbaren Referenzgenom GRCh38 des Homo sapiens zugeordnet, indem wir den STAR-Aligner v.2.5.2b verwendet haben, der einen gespleißten Aligner verwendet, um Spleißverbindungen zu erkennen und sie zu integrieren, um die Ausrichtung der gesamten Lesesequenzen zu unterstützen, was zu BAM-Dateien führt. Anschließend haben wir das Subread-Softwarepaket v.1.5.2 angewendet, das Feature-Counts verwendet, um die Anzahl eindeutiger Gentreffer zu berechnen. Wir haben nur eindeutige Lesevorgänge gezählt, die innerhalb der Exon-Regionen lagen, und die Tabelle mit den Gentrefferzahlen verwendet, um die nachgeschaltete differenzielle Expression zu analysieren.

Der primäre Endpunkt der Studie war die Sensitivität und Spezifität des LNG- oder MPA-Nachweises im Urin. Wir berechneten die Sensitivität als Gesamtzahl der Urinproben mit nachweisbarem LNG oder MPA mittels LC-MS/MS geteilt durch die Anzahl der Serumproben mit nachweisbarem LNG oder MPA pro Zeitpunkt. Wir haben die Spezifität als Anzahl der Urinproben mit nicht nachweisbarem LNG oder MPA dividiert durch die Anzahl der Serumproben mit nicht nachweisbarem LNG oder MPA zum jeweiligen Zeitpunkt berechnet. Wir haben auch die Sensitivität und Spezifität von Urin-LNG-Messungen mittels EIA berechnet. Wir haben 95 %-Konfidenzintervalle basierend auf genauen Tests für jede Sensitivitäts- und Spezifitätsschätzung berechnet.

Als explorativen Endpunkt suchten wir im Speichel nach Hinweisen auf eine unterschiedliche Expression spezifischer Gene nach der Einnahme von KOK oder der Injektion von MPA durch Freiwillige. Wir verwendeten DESeq2, um die Genexpression zu Studienbeginn (vor der Dosis) mit den Ergebnissen nach der Dosis aus den Speichelproben von COC- und MPA-Anwendern zu vergleichen. Durch die Anwendung des Wald-Tests haben wir p-Werte und log2-fache Änderungen generiert. Wir haben auch Gene identifiziert, deren p-Werte unter den Benjamini-Hochberg-angepassten kritischen Werten liegen. Wir haben diese Ergebnisse verwendet, um mehrere Vergleiche auszugleichen und eine Gesamtfehlerrate vom Typ 1 unter < 0,05 und absolute log2-fache Änderungen > 1 aufrechtzuerhalten, um die DEGs für jeden Vergleich zu bestimmen. Anschließend erstellten wir Vulkandiagramme unter Verwendung der 500 wichtigsten Gene, ausgewählt durch Log2-Fold-Change und angepasste p-Werte. Wir haben mit der Software GeneSCF v.1.1-p2 eine Genontologieanalyse des statistisch signifikanten Gensatzes durchgeführt. Wir haben die menschliche GO-Liste der Gene Ontology Annotation (GOA) verwendet, um den Satz von Genen basierend auf ihren biologischen Prozessen zu gruppieren und ihre statistische Signifikanz zu bestimmen. Wir haben eine Liste von Genen erstellt, die auf der Grundlage ihrer Genontologien geclustert wurden.

Zwischen August und November 2019 überprüften wir 41 potenzielle Teilnehmer und meldeten 30 bzw. 15 pro Gruppe an (Abb. 1). Alle Teilnehmer waren spanischer Abstammung, gemischter Abstammung, parös und hatten ein Durchschnittsalter von 29,5 Jahren (Tabelle 2). Alle 30 Teilnehmer schlossen die Studie bis Dezember 2019 ab, ohne dass SAEs oder AEs auftraten, die zu einem vorzeitigen Abbruch führten.

Studienflussdiagramm. Konsortialdiagramm, aus dem hervorgeht, dass 41 potenzielle Teilnehmer überprüft und 30 eingeschrieben wurden, davon 15 pro Gruppe (COC oder Depo).

Sensitivität/Spezifität von LNG im Urin: In Abb. In den Abbildungen 2A und B haben wir die quantifizierten Serum- und Urinwerte für die Tage 1 bzw. 3 dargestellt. Tabelle 3 zeigt die LC-MS/MS- und EIA-Sensitivitäts- und Spezifitätsergebnisse für Urin-LNG-Messungen von KOK-Anwendern. Mit beiden Methoden beobachteten wir eine 100-prozentige Spezifität, wobei bei keiner Person zu Studienbeginn (vor der KOK-Einnahme) nachweisbares LNG im Serum oder Urin auftrat. Nach der KOK-Einnahme war Serum-LNG bei allen Teilnehmern zu allen Entnahmezeitpunkten nachweisbar. Die Empfindlichkeit von Urin-LNG gemäß LC-MS/MS-Analyse betrug am ersten Tag sechs Stunden nach Dosis 1 80 % und am Tag 3 24 Stunden nach Dosis 2 60 % und sechs Stunden nach Dosis 3 93 %. Die Sensitivität mit EIA betrug zu jedem Zeitpunkt 100 %.

(A) Levonorgestrel (LNG)-Konzentrationen, gemessen mit der LCMS/MS-Methode in Serum- und Urinproben, wurden an den Tagen 1 und 3 der COC-Behandlung gesammelt. Keine Person zeigte zu Studienbeginn (Pre) nachweisbares LNG im Serum oder Urin, aber alle zeigten 6 Stunden nach der Einnahme an beiden Tagen (Tag 1 und 3) einen Anstieg. Nur acht von 15 Teilnehmern hatten zu allen drei Zeitpunkten nach Studienbeginn nachweisbare Werte. Bei sechs Teilnehmern lagen die LNG-Werte zum Tiefpunkt (24 Stunden nach Dosis 2) unter dem Quantifizierungsniveau, drei von ihnen hatten auch 6 Stunden nach der ersten Dosis nicht mehr nachweisbare Werte. (B) Levonorgestrel (LNG)-Konzentrationen, gemessen mit der EnzymeImmuno-Assay (EIA)-Methode in Urinproben, die am ersten und dritten Tag der COC-Behandlung entnommen wurden. Keine Person zeigte zu Studienbeginn (Prä) nachweisbare LNG-Werte im Serum oder Urin und wies zu allen Zeitpunkten nach der Einnahme an beiden Tagen (Tag 1 und 3) nachweisbare Werte auf. (C) Medroxyprogesteron (MPA)-Konzentrationen, gemessen mit der LC-MS/MS-Methode in Serum- und Urinproben, die am Tag 0 (Basislinie) sowie 21 und 60 Tage nach der Depo-Injektion entnommen wurden. Vier Personen hatten vor der Injektion nachweisbares MPA im Serum, zwei von ihnen hatten auch nachweisbares MPA im Urin. Die beiden Frauen mit nicht nachweisbarem MPA im Urin, aber nachweisbarem MPA im Serum wiesen Werte auf, die unter dem für die empfängnisverhütende Wirksamkeit erforderlichen Wert lagen (< 0,2 ng/ml). Eine Person mit nicht nachweisbarem MPA im Serum hatte nachweisbares MPA im Urin, wobei der Urinspiegel leicht über dem Serumschwellenwert lag (< 0,2 ng/ml). Wir haben MPA im Serum und Urin aller Teilnehmer 21 und 60 Tage nach der Injektion nachgewiesen.

LC-MS/MS-Ergebnisse zeigten, dass es bei allen Teilnehmern mindestens einen Zeitpunkt gab, an dem LNG im Urin nachweisbar war. Nur acht von 15 Teilnehmern hatten zu allen drei Zeitpunkten nach Studienbeginn nachweisbare Werte (Abb. 2A). Bei sechs Teilnehmern lagen die LNG-Werte zum Tiefpunkt (24 Stunden nach Dosis 2) unter dem Quantifizierungsniveau, drei von ihnen hatten sechs Stunden nach der ersten Dosis ebenfalls nicht nachweisbare Werte (Abb. 2A). Bis auf einen Teilnehmer wurde bei allen Teilnehmern sechs Stunden nach der dritten Dosis LNG per LC-MS/MS im Urin nachgewiesen. Bemerkenswert ist, dass bei dieser Person nach dem ersten und zweiten Zeitpunkt LNG im Urin nachgewiesen wurde. Die tatsächlichen LNG-Werte für alle Teilnehmer, die LCMS/MS und EIA verwenden, sind in Tabelle 2S dargestellt.

Tabelle 4 zeigt den LC-MS/MS-Nachweis von MPA in Urin- und Serumproben für MPA-Anwender. Von den 11 Teilnehmern mit nicht nachweisbarem MPA im Serum zu Studienbeginn hatten 10 Proben mit nicht nachweisbarem MPA im Urin, was einer Spezifität von 91 % vor der Dosis im Urin entspricht. Vier Personen hatten vor der Injektion nachweisbares MPA im Serum (Abb. 2C), zwei von ihnen hatten auch nachweisbares MPA im Urin. Beide Personen, bei denen MPA sowohl im Serum als auch im Urin nachgewiesen wurde, bestritten jegliche vorherige DMPA-Injektionen. Die beiden Teilnehmer mit nicht nachweisbarem MPA im Urin, aber nachweisbarem MPA im Serum wiesen Werte auf, die unter dem für die empfängnisverhütende Wirksamkeit erforderlichen Wert lagen (< 0,2 ng/ml). Sie gaben an, mehr als 12 Monate vor Studienbeginn (15 bzw. 17 Monate) DMPA-Injektionen erhalten zu haben. Bei der Person mit nicht nachweisbarem MPA im Serum war MPA im Urin nachweisbar, wobei der Urinspiegel leicht über dem Serumschwellenwert lag (< 0,2 ng/ml). Wir haben MPA im Serum und Urin aller Teilnehmer 21 und 60 Tage nach der Injektion nachgewiesen (100 % Sensitivität). In Tabelle 3S haben wir die tatsächlichen MPA-Werte für alle Teilnehmer dargestellt, die LC-MS/MS verwenden.

Unsere Analyse der RNA-Sequenzierung von Speichelproben der Teilnehmer, die DMPA verwendeten, ergab zu den drei Zeitpunkten eine unterschiedliche Anzahl von DEGs (Tabelle 5). Die Informationen in den Bi-Clustering-Heatmaps (Abb. 3A–C) veranschaulichen das visuelle Profil der DEGs aus Proben, die an den Tagen 21 (D21) und 60 (D60) im Vergleich zu Basislinienproben (Vorproben) und untereinander sortiert wurden durch ihre angepassten p-Werte ermittelt und mit ihren log2-transformierten Ausdruckswerten dargestellt. Für den Vergleich vor D21 (3a) beobachteten wir 10 unterschiedlich exprimierte Gene; Neun dieser Gene wurden hochreguliert und eines wurde herunterreguliert. Für die Zeit vor D60 (3b) sahen wir fünf DEGs; einer wurde herunterreguliert und vier wurden hochreguliert. Für den letzten Vergleich zwischen D21 und D60 (3c) gab es insgesamt 50 unterschiedlich exprimierte Gene, von denen 32 herunterreguliert und 18 hochreguliert waren. Die Vulkandiagramme der Genexpression im Speichel von DMPA-Anwendern entsprechend der Faltungsänderung und den angepassten p-Werten zeigen DEGs in unterschiedlichen Zeitintervallen (Abb. 4A – C). Wir haben die unterschiedlich exprimierten Gene, die anhand ihrer angepassten p-Werte sowie ihrer Standardfehler und Konfidenzintervalle (CIs) identifiziert wurden, in Tabelle 4S aufgelistet. Wir haben in Speichelproben von KOK-Anwendern im Vergleich zum Ausgangswert keine unterschiedlich exprimierten Gene festgestellt.

(A–C) Eine Bi-Clustering-Heatmap, die das visuelle Expressionsprofil der am häufigsten differenziell exprimierten Gene zeigt, sortiert nach ihrem angepassten p-Wert, indem ihre log2-transformierten Expressionswerte in Proben aufgetragen werden (erstellt mithilfe des Wald-Tests). (A) zeigt den Vergleich vor und D21, bei dem wir 10 unterschiedlich exprimierte Gene beobachteten, von denen neun hochreguliert und eines herunterreguliert war. (B) zeigt den Vergleich vor D60; wir sahen fünf unterschiedlich exprimierte Gene; einer wurde herunterreguliert und vier wurden hochreguliert. (C) zeigt den letzten Vergleich zwischen D21 und D60. Es gab insgesamt 50 unterschiedlich exprimierte Gene, von denen 32 herunterreguliert und 18 hochreguliert waren.

(A–C) Vulkandiagramme zur Visualisierung des Expressionsprofils der am häufigsten differentiell exprimierten Gene, sortiert nach ihrem angepassten p-Wert, indem ihre log2-transformierten Expressionswerte aufgetragen werden. Herunterregulierte DEGs sind in Rot und hochregulierte DEGs in Blau gekennzeichnet.

Diese Studie stellt ein neuartiges Unterfangen auf dem Gebiet der Empfängnisverhütung dar, um die individuelle Anwendung hormoneller Methoden durch die Messung von Biomarkern in Urin- und Speichelproben zu bestätigen. Wir konnten zeigen, dass wir native Hormone (LNG oder MPA) in geringen Konzentrationen im Urin mithilfe von LC-MS/MS in Proben von Teilnehmern messen können, die KOK oder DMPA verwendet haben. Die Sensitivität für LNG betrug 6 Stunden nach der Dosis am Tag 3 93 % [68–100 %] und die Sensitivität für MPA betrug 100 % an den Tagen 21 und 60; Die Spezifität betrug 91 % [59–100 %]. Unsere Ergebnisse liefern starke Unterstützung für die Fortsetzung weiterer Untersuchungen zur Bestätigung unserer Ergebnisse hinsichtlich der Verwendung von Urinproben zur Identifizierung eines Biomarkers für die Verwendung hormoneller Verhütungsmittel. Wir schlagen vor, die im Urin vorhandenen Referenzmetaboliten für LNG und MPA zu synthetisieren und die Metabolitenkonzentrationen im Urin mittels LC-MS/MS zu messen. Es wird erwartet, dass die Metabolitenkonzentration(en) viel höher ist als die der intakten Hormone29,30,31. Daher sind wir zuversichtlich, dass die Messung spezifischer Urinmetaboliten die Sensitivität und Spezifität verbessern und die weitere Entwicklung der Verwendung von Urinproben als Biomarker für die Verwendung hormoneller Kontrazeptiva fördern wird.

Unseres Wissens sind unsere Ergebnisse die ersten, die die Möglichkeit belegen, LNG-Konzentrationen in Urinproben mit dem DetectX-Kit zu messen. Im Vergleich zu unseren Ergebnissen mit der LC-MS/MS-Technologie waren die mittels EIA gemessenen LNG-Konzentrationen im Urin viel höher. Dieses Ergebnis war nicht überraschend, da die EIA-LNG-Methode auf polyklonalen Antikörpern basiert, die sowohl an LNG als auch an seine Metaboliten binden. Wir müssen bestätigen, ob dieses EIA-Ergebnis auf die Kreuzreaktion der im Urin vorhandenen LNG-Metaboliten mit den in den DetectX-Kits verwendeten polyklonalen Anti-LNG-Antikörpern zurückzuführen ist, und vorschlagen, die spezifischen Referenzmetaboliten zu synthetisieren, um das LNG-EIA-Kit weiter zu validieren zur korrekten Messung von LNG und Metaboliten im Urin. In ähnlicher Weise werden die Referenzmetaboliten dazu beitragen, die Sensitivität/Spezifität der Messung von Metaboliten im Urin mittels EIA zu erhöhen, was im Vergleich zur LC-MS/MS-Technologie eine kostengünstigere und zugänglichere Methode für den Einsatz in Umgebungen mit geringen Ressourcen sein kann.

Unsere Untersuchung von Speichelproben liefert vorläufige Beweise dafür, dass Speichel zur Identifizierung eines Biomarkers für die Verwendung hormoneller Verhütungsmittel verwendet werden könnte. Basierend auf der jüngsten Identifizierung der unterschiedlichen Genexpression in Speichelproben von Krebspatienten, die den Weg für die Erforschung von Speichel als Biomarker für verschiedene Erkrankungen ebnete32,33,34, stellten wir die Hypothese auf, dass der Einsatz hormoneller Verhütungsmittel zu einer Erhöhung oder Verringerung der Regulierung einiger selektiver Gene bei Personen, die DMPA oder ein COC verwenden. Wie in den Heatmaps dargestellt, fanden wir in der Gruppe, die DMPA an Tag 21 und Tag 60 verwendete, im Vergleich zum Ausgangswert zahlreiche unterschiedlich exprimierte Gene, von denen die meisten zuvor im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsentitäten oder Zuständen beschrieben wurden. Interessanterweise scheinen die in unserer Studie festgestellten Veränderungen mit den Nebenwirkungen übereinzustimmen, die einige Personen bei der Verwendung von DMPA berichten. Bei einigen DMPA-Anwendern wird beispielsweise sowohl über Gewichtszunahme35 als auch über Alopezie36 berichtet, und unsere Analyse der differentiellen Genexpression zeigte, dass das CRTC-Gen (CREB-regulated transcription coactivator 3), das bei Fettleibigkeit eine Rolle spielt35 und PRMT9 (Protein-Arginin-Methyltransferase 9 )-Gen, das mit mandibulofazialer Dysostose mit Alopezie in Verbindung gebracht wurde, wurden beide hochreguliert. Darüber hinaus stellten wir fest, dass N-Acetyltransferase1, die am Folatkatabolismus37,38 beteiligt ist, herunterreguliert war. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einem Bericht des Centers for Disease Control, in dem festgestellt wird, dass DMPA-Anwender bei der Serumfolatkonzentration wahrscheinlich im untersten Quartil (≤ 6,2 ng/ml) eingestuft werden39. Wir haben außerdem festgestellt, dass das Galectin-3-bindende Protein lgals3bp, das als wichtiger klinischer Tumorbiomarker40,41,42 gilt, bei DMPA-Anwendern herunterreguliert war. Interessanterweise wurde berichtet, dass die Verwendung von DMPA einen dramatischen Rückgang der Proliferation des Endometriumepithels hervorruft, und wird sogar als chemopräventives Mittel bei Personen mit Lynch-Syndrom vorgeschlagen43. Weitere bestätigende Studien sind erforderlich, um zu zeigen, ob eines dieser unterschiedlich exprimierten Gene, die für diese anderen Erkrankungen identifiziert wurden, auch als Biomarker im Speichel von DMPA-Anwendern dienen könnte.

Im Gegensatz dazu konnten wir in Speichelproben von KOK-Anwendern, die 24 und 72 Stunden nach der Einnahme entnommen wurden, keine unterschiedliche Genexpression feststellen. Das negative Ergebnis könnte auf die kurzen Zeitpunkte und Reihenfolgen zurückzuführen sein, die wir bei der Speichelprobenahme von KOK-Anwendern eingehalten haben. Wahrscheinlich waren die Veränderungen der mRNA-Spiegel bei KOK-Anwendern nach nur 24 und 72 Stunden Anwendung vergleichsweise gering. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Hormonen im Speichel genau zu beurteilen, hängt von der biochemischen Natur der Hormone und dem Mechanismus ab, durch den die Hormone, z. B. LNG, in die Mundhöhle gelangen44,45. Daher könnten die nicht nachweisbaren Genveränderungen bei KOK-Anwendern nach 24–72 Stunden Anwendung mit dem spezifischen Transportmechanismus von LNG in den Speichel zusammenhängen, der weiter untersucht werden muss.

Darüber hinaus haben wir in dieser Studie nur eine Gesamt-RNA-Sequenzierung durchgeführt, die hauptsächlich kodierende RNA erkennt. Ergebnisse neuerer Studien haben gezeigt, dass lange nichtkodierende RNA und Mikro-RNA über verschiedene Mechanismen interagieren können, um mRNA zu regulieren46. Zukünftige Forschungsbemühungen, bei denen wir längere COC-Anwendungsperioden (und Speichelsammelzeiten) sowie eine microRNA-Sequenzierung anwenden, die Tausende kleiner nichtkodierender RNA-Sequenzen mit beispielloser Empfindlichkeit abfragt, könnten es uns ermöglichen, unterschiedlich exprimierte Gene bei COC-Benutzern zu identifizieren.

Diese Studie hatte sowohl Stärken als auch Einschränkungen. Unsere Ergebnisse, die zeigen, dass Urinproben zur Identifizierung eines Biomarkers für die Verwendung hormoneller Kontrazeptiva verwendet werden können, haben den Grundstein für die weitere Entwicklung gelegt, einschließlich eines Weges zur Identifizierung diagnostischer Methoden mithilfe von Urinproben, die einfach und umfassend angewendet werden können. Die Tatsache, dass wir keine Derivatisierungstechnologie zur Messung des Hormonspiegels eingesetzt haben, stellte eine Einschränkung der Studie dar. Mit dieser Methode hätten wir wahrscheinlich die Erkennung niedrigerer Hormonspiegel in Urinproben verbessern und die Empfindlichkeit unserer Ergebnisse für die Erkennung sowohl des COC- als auch des DMPA-Konsums verbessern können. Eine weitere Einschränkung bestand darin, dass wir die LNG/MPA-Grundblutspiegel der Freiwilligen vor Beginn der Behandlung mit KOK oder DMPA nicht gemessen haben. Diese Datenpunkte hätten unsere aus den Urinproben erhaltenen Spezifitätsergebnisse verbessern können.

Was unsere Ergebnisse mit Speichel betrifft, so deuten unsere positiven Ergebnisse bei DMPA-Anwendern darauf hin, dass wir diese leicht zu gewinnende Körperflüssigkeit möglicherweise zur Identifizierung von Biomarkern für die Verwendung hormoneller Verhütungsmittel verwenden können. Die Verwendung der RNA-Sequenzierungstechnologie nur für diese Phase der Studie hat uns möglicherweise daran gehindert, irgendeine unterschiedliche Expression im Speichel von KOK-Anwendern nachzuweisen, und war eine Schwäche der Studie. Darüber hinaus ist es möglich, dass Veränderungen in der Genexpression im Speichel kumulativ sind, und daher stellte der kurze Zeitrahmen, den wir zur Untersuchung solcher Veränderungen verwendeten, eine zusätzliche Schwäche dar. Wir müssen weitere Untersuchungen durchführen, um die Auswirkungen einer längeren Exposition gegenüber KOK-Konsum auf die differenzielle Genexpression zu bewerten, und Mikro-RNA-Sequenzierung anwenden, um zusätzliche Informationen zu erhalten und festzustellen, ob weitere Untersuchungen für die Verwendung von Speichelproben zur Erkennung von Biomarkern für den KOK-Konsum erforderlich sind.

Insgesamt deuten die durch unsere Ergebnisse aufgezeigten Möglichkeiten darauf hin, dass wir möglicherweise Urin oder Speichel verwenden können, um neuartige Biomarker zu entwickeln, die auf die Verwendung hormoneller Verhütungsmittel hinweisen, die in der öffentlichen Gesundheitsforschung eingesetzt werden könnten und auch Auswirkungen auf die klinische Forschung und die klinische Versorgung haben könnten.

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Diese Studie wurde durch eine Untervereinbarung der Johns Hopkins University mit Mitteln unter der Fördernummer OPP1172551 (Improving Measurement and Program Design) der Bill and Melinda Gates Foundation unterstützt. Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der Bill and Melinda Gates Foundation oder der Johns Hopkins University wieder. Wir danken Dr. George Creasy für seine Beratung bei der Protokollentwicklung und der medizinischen Überwachung der Studie; an Dr. Lisa Haddad für die sorgfältige Durchsicht und Bearbeitung mehrerer Manuskriptentwürfe; an Lorna Begg für Unterstützung bei der endgültigen Formatierung; und an Craig Savel und Divea Venkatasetty für Unterstützung bei der Datenverwaltung. Wir möchten uns bei den 30 Frauen bedanken, die an der Studie teilgenommen haben.

Zentrum für biomedizinische Forschung, Bevölkerungsrat, 1230 York Avenue, New York, NY, 10065, USA

Rakhee Sachdeva, Narender Kumar, Barbara A. Friedland, Marlena Plagianos, Shimin Zhang, Larisa Kizima und Ruth B. Merkatz

Profamilia Clinic, Nicolas de Ovando Esq. Calle 16, Ens. Luperon, Santo Domingo, Dominikanische Republik

Vivian Brache, Leila Cochon und Ana Sofía Tejada Tabar

Gold Canyon, USA

Ann Blanc

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RS konzipierte und plante die Experimente mit Speichel als Biomarker für die Anwendung von Verhütungsmitteln, kuratierte die Daten aus Speichelproben, analysierte die EIA- und LCMS-Daten für Urin und Serum und verfasste/bearbeitete technische Abschnitte des Manuskripts. NK konzipierte und plante die Experimente mit Urin als Biomarker für die Anwendung hormoneller Verhütungsmittel, überwachte und kuratierte die Ergebnisse für LNG und MPA aus Serum- und Urinproben, trug zur Protokollentwicklung bei und verfasste/bearbeitete technische Abschnitte des Manuskripts. VB führte und überwachte die Datenerfassung, einschließlich Rekrutierungs- und Einverständniserklärungen, als Hauptprüfer am klinischen Standort. BF war Co-Autor des Studienprotokolls, schulte das Studienpersonal, führte eine (Fern-)Überwachung des klinischen Standorts gemäß der Guten Klinischen Praxis durch und trug zum Verfassen/Bearbeiten des Manuskripts bei. MP entwickelte Datenmanagement- und statistische Analysepläne, überprüfte alle klinischen Standortdaten, entwickelte und führte Sensitivitäts- und Spezifitätsanalysen für Serum- und Urindaten durch und trug zum Verfassen/Bearbeiten des Manuskripts bei. SZ analysierte alle COC- und MPA-Proben mittels LCMS/MS. LK führte alle EIA-Experimente an allen Urinproben durch. LC führte Verfahren mit freiwilligen Studienteilnehmern am Studienort durch und behandelte alle Proben gemäß dem Protokoll. AST führte Verfahren mit freiwilligen Studienteilnehmern am Studienort durch und behandelte alle Proben gemäß dem Protokoll. AB initiierte die Erforschung von Biomarkern für den Einsatz hormoneller Verhütungsmittel, sicherte die Finanzierung der Studie und trug zur Protokollentwicklung bei. RBM konzipierte und entwickelte die Studie und das Studienprotokoll mit, betreute das Projekt und verfasste den Großteil des Manuskripts. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript überprüft und genehmigt.

Korrespondenz mit Ruth B. Merkatz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Sachdeva, R., Kumar, N., Brache, V. et al. Neue Ansätze zur Entwicklung von Biomarkern für den Einsatz hormoneller Kontrazeptiva. Sci Rep 13, 245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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Eingegangen: 10. Dezember 2021

Angenommen: 11. November 2022

Veröffentlicht: 05. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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