Stress

Apr 29, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 602 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die integrierte Stressreaktion (ISR) spielt eine zentrale Rolle in der zellulären Stressreaktion, vor allem durch den globalen Translationsstopp und die Hochregulierung zellulärer, mit der Anpassung verbundener Moleküle. Der Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15 (Gdf15) ist ein wirksamer, auf Stress reagierender Biomarker für klinische Entzündungs- und Stoffwechselstörungen bei verschiedenen Arten von Krankheiten. Hier untersuchen wir, ob ISR-gesteuerter zellulärer Stress durch Modulation von Gdf15 zu pathophysiologischen Ergebnissen beiträgt. Die klinische Transkriptomanalyse zeigt, dass PKR positiv mit der Gdf15-Expression bei Patienten mit Nierenschädigung assoziiert ist. Die Gdf15-Expression hängt von der Proteinkinase R (PKR)-verknüpften ISR während einer akuten Nieren-Darm-Beschwerde bei Mäusen ab, und die genetische Ablation von Gdf15 verschlimmert chemisch induzierte Läsionen im Nierengewebe und der Darmbarriere. Eine eingehende Untersuchung der Darmmikrobiota zeigt, dass Gdf15 mit der Häufigkeit von Bakterien und ihren Enzymen, die mit dem Muzinstoffwechsel in Verbindung stehen, zusammenhängt. Darüber hinaus erleichtert stressresponsives Gdf15 die Mucinproduktion und das Überleben der Zellen durch die Neuorganisation des Autophagie-Regulationsnetzwerks. Insgesamt wirkt ISR-aktiviertes Gdf15 pathologischen Prozessen durch die schützende Neuprogrammierung des autophagischen Netzwerks und der mikrobiellen Gemeinschaft entgegen und stellt so robuste prädiktive Biomarker und Interventionen gegen renointestinale Beschwerden bereit.

Renointestinale Beschwerden sind eine pathologische Folge einer beeinträchtigten interorganischen Kommunikation zwischen Darm und Niere. Es häufen sich Hinweise darauf, dass der Magen-Darm-Trakt eine Hauptquelle für Mikroben und immunbezogene Zellen ist, die bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (AKI) oder chronischer Nierenerkrankung (CKD) zu entzündlichen Erkrankungen führen1,2,3. Ebenso wurden renale Manifestationen, einschließlich Nierentubulusverletzung, Nephrolithiasis, tubulointerstitielle Nephritis, Glomerulonephritis und Amyloidose, bei 4–23 % der Patienten mit Darmbarriereproblemen, wie z. B. einer entzündlichen Darmerkrankung, berichtet4,5,6. Experimentell wurde gezeigt, dass eine fortgeschrittene chronische Nierenerkrankung eine Schädigung der Darmschleimhautbarriere und nachfolgende systemische Entzündungen auslösen kann, wodurch sich die Schwere der Erkrankung verschlimmert3. Insbesondere das Ausmaß der Bakteriämie oder Endotoxämie hängt stark mit der Schwere der Erkrankung bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung zusammen7,8. Aus dem Darm stammende schädliche Faktoren, darunter schädliche Mikrobiota, Endotoxine und urämische Toxine, tragen zur Nierenschädigung bei9. Ein weiteres repräsentatives klinisches Modell für Nieren-Darm-Beschwerden ist eine durch Chemotherapie verursachte Komplikation10,11, obwohl platinbasierte Chemotherapeutika wie Cisplatin (CP) häufig zur Behandlung von soliden Tumoren und hämatologischen Malignomen eingesetzt werden12. Einer 6-jährigen Kohortenuntersuchung zufolge kam es bei etwa 34 % der erwachsenen Patienten mit verschiedenen Krebsarten, denen eine CP-Chemotherapie verabreicht wurde, zu AKI, wobei die meisten Patienten langfristige Nierenschäden aufwiesen, wie z. B. einen leichten, aber dauerhaften Rückgang der geschätzten glomerulären Filtration Rate (eGFR)13. Zusätzlich zu Nierenschäden wurde eine Chemotherapie mit der Auslösung einer Mukositis in Verbindung gebracht14. Trotz der positiven Wirkung von Krebsmedikamenten entwickeln Berichten zufolge 20–40 % der Patienten mit soliden Tumoren nach einer Krebstherapie eine Mukositis15. Schnell wachsende Zellen oder Gewebe, wie etwa die Schleimhäute von Mund, Magen und Darm, sind primäre Ziele schädlicher Wirkungen, die durch Krebsmedikamente über genotoxische Stressoren vermittelt werden16.

Der Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15 (Gdf15) ist ein Mitglied der Transforming Growth Factor (TGF)-β-Superfamilie und wird durch verschiedene pathologische Reize induziert, darunter Gewebeverletzungen, Entzündungen und onkogene Beleidigungen17,18,19. Basierend auf gesammelten Beweisen ist Gdf15 an homöostatischen Zellreaktionen beteiligt und spielt eine schützende Rolle sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Zuständen, einschließlich chronischer Entzündung und Tumorentstehung20,21,22,23. Angesichts der Tatsache, dass die Gewebeexpressionsniveaus von Gdf15 stark mit den sekretierten Gdf1524-Niveaus korrelieren, könnten zirkulierende Gdf15-Niveaus möglicherweise Gewebeschäden darstellen. Bemerkenswerterweise wurden die Gdf15-Spiegel im Blut positiv mit Nierenfunktionsstörungen oder -schäden während des Alterns oder dem Fortschreiten der Krankheit, einschließlich CKD, in Verbindung gebracht24,25,26.

Als Reaktion auf verschiedene interne und externe Stressfaktoren aktivieren eukaryontische Zellen einen gemeinsamen adaptiven Weg, die integrierte Stressreaktion (ISR), um die zelluläre Integrität wiederherzustellen. Das zentrale biochemische Ereignis bei ISR ​​ist die Phosphorylierung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2 alpha (eIF2α) durch die eIF2α-Kinasefamilie, die zu einem globalen Translationsstopp und der Induktion spezifischer auf Stress reagierender Gene führt, um eine biologische Homöostase zu erreichen27,28. Hier haben wir festgestellt, ob ISR-gesteuerter zellulärer Stress über die Modulation von Gdf15 bei Nieren-Darm-Beschwerden zu pathophysiologischen Ergebnissen beiträgt. Basierend auf der Annahme, dass Gdf15 ein auf Stress reagierendes Molekül ist, das mit Gewebeverletzungen in Zusammenhang steht, wurden seine Wirkungen bei Nieren-Darm-Beschwerden mithilfe des klinischen Transkriptoms und Tierverletzungsmodellen vorhergesagt. Zusätzlich zu den unerwünschten Folgen für die Nieren wurde eine schleimhautspezifische Nische, einschließlich der mikrobiellen Gemeinschaft und der Darmepithelbarriere, bei der komplexen Kommunikation zwischen den Organen zwischen Darm und Niere angesprochen. Unsere Ergebnisse würden neue Einblicke in die Prognose und Intervention bei Nieren-Darm-Beschwerden liefern.

Basierend auf der Annahme, dass ISR-verknüpfte zelluläre Prozesse an der Modulation von Nierenbeschwerden beteiligt sind, wurde die Expression von vier globalen stressbedingten Säugetier-eIF2α-Kinasen, nämlich EIF2AK1 (HRI), EIF2AK2 (Proteinkinase R; PKR), EIF2AK3 (Proteinkinase R -ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase (PERK) und EIF2AK4 (GCN2) wurden bei Patienten mit AKI verglichen (Abb. 1a). Die EIF2AK2 (PKR)-Expression war im Vergleich zu den Expressionsniveaus anderer eIF2α-Kinasen von Säugetieren deutlich erhöht. Eine auf dem klinischen Transkriptom basierende Analyse ergab, dass Patienten mit AKI oder CKD erhöhte PKR-Werte aufwiesen (Abb. 1b, c). Obwohl die PERK-Werte bei Patienten mit AKI nicht signifikant erhöht waren, wurden bei Patienten mit CKD erhöhte Werte beobachtet (ergänzende Abbildung s1a, b). Wir analysierten auch die mit menschlichem AKI und CKD assoziierte Gdf15-Expression in klinischen Genomdatensätzen (GSE30718 bzw. GSE66494). Wir beobachteten, dass die relative Expression von Gdf15 bei Patienten mit AKI und CKD signifikant höher war als in der Kontrollgruppe (Abb. 1d bzw. e). Darüber hinaus zeigten Probanden mit erhöhten PKR-Werten oder ihrem repräsentativen Ziel, dem C/EBP-homologen Protein (CHOP), tendenziell höhere Gdf15-Werte als Probanden mit niedriger PKR- oder CHOP-Expression (Abb. 1f [AKI] und 1 g [CKD]). Dies deutet auf einen positiven Zusammenhang zwischen der PKR-Signalisierung und der Gdf15-Expression hin. Im Gegensatz dazu war die PERK-Expression bei Patienten mit AKI oder CKD nicht signifikant mit den Gdf15-Spiegeln assoziiert (ergänzende Abbildung s1c bzw. d).

a Die Expressionsniveaus der eIF2α-Kinase-Gene (EIF2AK1, EIF2AK2, EIF2AK3 und EIF2AK4) wurden bei jedem Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718) verglichen. b–e Die Expression von PKR (b, c) oder Gdf15 (d, e) wurde bei Patienten mit Nierenschäden, einschließlich akuter Nierenschädigung (GSE30718, b und d) oder chronischer Nierenerkrankung (GSE66494, c und e), bestimmt. Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern dargestellt. Die Sternchen (∗) zeigen signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen an (∗p < 0,05, ***p < 0,001). f–g Basierend auf den PKR- oder C/EBP-homologen Protein (CHOP)-Werten wählten wir die 20 Proben mit dem höchsten und 20 niedrigsten Wert aus, die auf der Grundlage der Gdf15-Werte bei Patienten mit Nierenschäden, einschließlich akuter Nierenschädigung, weiter ausgewertet wurden (GSE30718, f) oder chronische Nierenerkrankung (GSE66494, g). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Die Sternchen (∗) geben signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an (∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01 unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests). h–i HK-2-Zellen (h) und HCT8-Zellen (i), die mit Kontrolle (der negativen Kontroll-shRNA) oder shPERK- oder shPKR-Plasmid transfiziert waren, wurden 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l Cisplatin (CP) behandelt. Zelllysate wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. eIF2α, eukaryotischer Initiationsfaktor 2 alpha; Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15; PKR, Proteinkinase R; PERK, Proteinkinase-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase.

Gdf15 wurde mechanistisch als stressinduzierter Faktor als Reaktion auf Platinexposition bei Nieren-Darm-Beschwerden bewertet. In Übereinstimmung mit der klinischen transkriptomischen Auswertung wurde die renale Stressreaktion auf CP mithilfe von HK-2-Zellen bewertet, einer gut etablierten immortalisierten proximalen Tubulus-Epithelzelllinie, die aus normalen erwachsenen menschlichen Nieren stammt29. Darüber hinaus wurden Darmstressreaktionen in der HCT-8-Zelllinie simuliert, einem weit verbreiteten menschlichen Darmepithelzellmodell für entzündliche und infektiöse Erkrankungen30,31. Basierend auf der 24-Stunden-Lebensfähigkeit der Zellen (ergänzende Abbildungen s2a, b) wurden die folgenden zellbasierten Bewertungen bei CP-Dosen durchgeführt, die den IC50-Werten zu jeder gegebenen Expositionszeit entsprachen. Als Reaktion auf die CP-Behandlung zeigten HK-2- und HCT-8-Zellen eine erhöhte Gdf15-Expression (Abb. 1h, i). Zusätzlich zu genotoxischem Stress wurde festgestellt, dass CP über eine starke Bindung an RNA und Ribosomen die Organellenfunktionen, einschließlich der Translationsmaschinerie, stört32,33,34,35,36,37. Daher wurden unter den verschiedenen Arten von eIF2α-Kinase-verknüpften Signalwegen in ISR RNA-abhängige PERK- und doppelsträngige RNA-abhängige PKR-assoziierte Signale untersucht, um ihren möglichen Einfluss auf die Gdf15-Expressionsniveaus zu bestimmen. Spezifische kleine Haarnadel-RNAs (shRNAs) wurden verwendet, um PERK oder PKR auszuschalten und deren Einfluss auf die Gdf15-Expression zu bestimmen. Im Vergleich zur PERK-Expression war PKR in beiden Zelltypen deutlich an der CP-induzierten Gdf15-Expression beteiligt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die PKR-verknüpfte Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei der Gdf15-Expression während einer Nierenschädigung spielt.

Insbesondere untersuchten wir, ob ein hohes Maß an Gdf15-Expression mit der Prognose einer Nierenpathologie in einem Mausmodell für CP-induziertes AKI zusammenhängt. Das Kaplan-Meier-Überlebensdiagramm ergab, dass Gdf15-defiziente Mäuse nach CP-Behandlung eine schlechtere Prognose aufwiesen als Wildtyp-Mäuse (Abb. 2a); Dies deutete auf die durch Gdf15 vermittelten Schutzwirkungen gegen akute Nierenschäden und unerwünschte Folgen hin. Die grobanatomische Beobachtung der Nieren ergab im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen bei Gdf15-Knockout-Mäusen (KO-Mäusen) als Reaktion auf die CP-Behandlung umfangreiche Gewebeschäden (Abb. 2b). Zur Überprüfung von Nierenfunktionsstörungen wurden die Kreatinin- und Blut-Harnstoff-Stickstoffspiegel (BUN) gemessen. Nach der CP-Behandlung waren die Kreatin- und BUN-Spiegel bei Gdf15 KO signifikant höher als bei Wildtyp-Mäusen (Abb. 2c bzw. d). Darüber hinaus führten wir eine quantitative Bewertung von Nierengewebeverletzungen mittels Periodic Acid-Schiff (PAS)-Färbung durch (Abb. 2e) und stellten bei Gdf15-KO-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen hohen Grad an tubulärer Dilatation und tubulärer Vakuolisierung fest Reaktion auf CP (Abb. 2f, g). Darüber hinaus war bei Gdf15-KO-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine CP-induzierte Zystenbildung festzustellen (Abb. 2h). Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine schützende Rolle von Gdf15 gegen CP-induzierte Nierenschäden hin.

Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-Knockout-Mäuse (KO) wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder CP (20 mg/kg, intraperitoneal) behandelt (n = 3 – 5). eine Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von Wildtyp- und Gdf15-KO-Mäusen, die mit CP behandelt wurden (n = 3 − 5, p < 0,01). b Bruttoanatomie von Nierenschnitten von unbehandelten Mäusen und CP-behandelten Mäusen (Periodsäure-Schiff-Färbung [PAS]) (Vergrößerung 5-fach; Maßstabsbalken 1 mm). Die Serumspiegel von Kreatinin (c) und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) (d) wurden 72 Stunden nach der CP-Behandlung mit einem kolorimetrischen Assay-Kit gemessen, wie im Abschnitt „Methode“ beschrieben. Die Ergebnisse werden als Balkendiagramm mit Durchschnitt und Standardabweichung angezeigt, und unterschiedliche Buchstaben über jedem Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). e Histologische Untersuchung von PAS-gefärbten Nierenschnitten (Vergrößerung, 400-fach; Maßstab(e), 50 μm). Quantitative Analyse der tubulären Dilatation (f), tubulären Vakuolisierung (g) und Zystenbildung (h). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Unterschiedliche Buchstaben über jedem Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Neben Nierenbeschwerden ist Mukositis eine bekannte Komplikation im Zusammenhang mit CP-induzierten Komplikationen14. Wir untersuchten die Auswirkungen eines Gdf15-Mangels auf CP-induzierte Mukositis bei Mäusen. Basierend auf groben anatomischen Beobachtungen verschlimmerte ein Gdf15-Mangel die CP-induzierte Verkürzung des Dünndarms der Maus unter Berücksichtigung der Längslänge erheblich (Abb. 3a). Nach der mikroskopischen Untersuchung der Darmepithelschicht stellten wir bei CP-exponierten Mäusen eine Abstumpfung oder Verkürzung der Zotten oder Krypten fest, die bei Gdf15-KO-Mäusen deutlich schwerwiegend war (Abb. 3b, c). Die mit Gdf15 verbundene Verkürzung der Länge der Schleimhaut, der Zotten und der Krypten deutete auf eine Verringerung der für die Nährstoffaufnahme verfügbaren Dünndarmluminaloberfläche hin. Darüber hinaus ergab die histopathologische Bewertung des pathologischen Schweregrads, dass ein Gdf15-Mangel den CP-induzierten Kryptaverlust verschlimmern könnte (Abb. 3d – g). Bemerkenswert ist, dass ein Gdf15-Mangel Entzündungen und Geschwüre verstärkte, die im Ileum stärker ausgeprägt waren als im Jejunum (Abb. 3f, g).

Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-Knockout (KO)-Mäuse (n = 3–5) wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder Cisplatin (CP; 20 mg/kg) behandelt. a Die durchschnittliche Länge des Dünndarms jeder Gruppe. b–c Durchschnittliche Längen der Zotten (links) und der Krypta (rechts) im Jejunum (b) und Ileum (c). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Unterschiedliche Buchstaben über Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). d–g Histologische Untersuchung von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Abschnitten des Jejunums (d) und Ileums (e) (Vergrößerung 100-fach; Maßstab(e) 100 μm). Quantifizierung der pathologischen Schwere des Jejunums (f) und Ileums (g). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Die Sternchen (∗) geben signifikante Unterschiede zwischen Gruppen an (∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Zusätzlich zu CP-induzierten Darmverletzungen haben wir ein genau definiertes Modell für Colitis ulcerosa unter Verwendung von Dextrannatriumsulfat (DSS) untersucht. Als Reaktion auf die DSS-Behandlung zeigten Gdf15-KO-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen ein erhöhtes Maß an Entzündung, Geschwürbildung, Kryptaverlust und Ödemen im Dickdarm (Abb. 4a, b). Wir haben ein repräsentatives Modell einer chronischen Nierenerkrankung durch Behandlung mit einer fettreichen Diät (HFD) untersucht (Ergänzende Abbildung s3). In diesem Modell konnten wir keine nennenswerten histologischen Defekte im Darm feststellen, während eine chronische Exposition gegenüber HFD (12 Wochen) zu Nierenschäden wie einer tubulären Erweiterung führte. Gdf15 trug jedoch nicht zu HFD-induzierten renalen pathologischen Ereignissen bei. Unter der Annahme, dass eine Darmverletzung mit nachteiligen Folgen für die Niere verbunden ist, haben wir außerdem festgestellt, ob eine Kolitis-auslösende Schädigung die Nierenintegrität beeinträchtigt. Tiere mit Dextran-Natriumsulfat (DSS)-induzierter Colitis ulcerosa zeigten pathologische Folgen in der Niere, einschließlich erhöhter BUN-Werte und tubulärer Dilatation, was bemerkenswerte Gdf15-KO-Tiere waren (Abb. 4c, d). Zusätzlich zur tubulären Belastung stellten wir fest, dass ein Gdf15-Mangel glomeruläre Verletzungen verstärkte, einschließlich morphologischer Schrumpfung und Neutrophileninfiltration im DSS-induzierten Kolitis-Modell (Abb. 4e). Insgesamt trug der Gdf15-Mangel zu histologischen Veränderungen und pathologischem Schweregrad in den Nieren-Darm-Verletzungsmodellen bei.

Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-Knockout (KO)-Mäuse (n = 3–5) wurden 8 Tage lang mit Vehikel oder 3 % DSS behandelt. Histologische Untersuchung von mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Dickdarmschnitten (a). Quantifizierung der pathologischen Schwere des Dickdarms (b) (Vergrößerung, 200-fach; Maßstab(e), 100 μm). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Die Sternchen (∗) weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen hin (∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001). c Histologische Untersuchung von mit Periodsäure-Schiff (PAS) gefärbten Nierenschnitten (Vergrößerung, 400-fach; Maßstab(e), 50 μm). d Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) wurde 48 Stunden nach der DSS-Behandlung mit einem kolorimetrischen Assay-Kit gemessen. Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern dargestellt. Die Sternchen (∗) weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen hin (**p < 0,01). e Quantitative Analyse der tubulären Dilatation, glomerulären Schrumpfung und glomerulären Sklerose. Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Die Sternchen (∗) weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen hin (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Die Darmschleimhautschicht wurde weiter untersucht, da sie eine entscheidende Barriere gegen entzündungsfördernde Auslöser, einschließlich Mikroben und deren Bestandteile, darstellt. In Anbetracht der Schleimhautabwehr verringerte die CP-Exposition die Anzahl der Becherzellen und verringerte die Schleimsekretion in der Ileum-Epithelschicht, was bei Gdf15-KO-Mäusen noch verstärkt wurde (Abb. 5a, b). Zusätzlich zum Dünndarm verringerte ein Gdf15-Mangel die Mucinsekretion im Dickdarm, was auf die Schutzfunktion von Gdf15 für Becherzellen oder deren Mucinproduktion hinweist. Daher verursachte Gdf15 KO auch im DSS-induzierten Kolitis-Modell einen schweren Verlust der Schleimhautschicht (Abb. 5c). Eine Gram-Färbung wurde durchgeführt, um die Lumenbakterien zu lokalisieren und die Dicke der inneren Schleimhautschicht abzuschätzen. Gdf15-defiziente Epithelzellen standen aufgrund der verringerten Schleimhautbarriere in engem Kontakt mit der Lumenmaterie, die diätetische und mikrobielle Faktoren enthielt (Abb. 5d). Anschließend könnten sich Lumenbakterien leicht in das innere Gewebe verlagern und eine entscheidende Rolle bei der Auslösung entzündlicher Schäden im Gefäßsystem und anderen Zielorganen, einschließlich der Nieren, spielen. Die vorliegenden Erkenntnisse legen nahe, dass die Gdf15-vermittelte Integrität der Epithel- und Schleimhautbarriere der zirkulierenden Freisetzung von aus dem Darm stammenden renotoxischen oder proinflammatorischen Faktoren entgegenwirkt.

a Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-Knockout-Mäuse (KO) (n = 3–5) wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder Cisplatin (CP; 20 mg/kg) behandelt. Färbung der Ileumschleimhaut mit Alcianblau (Vergrößerung, 200-fach; Maßstabsbalken, 100 μm) und deren Quantifizierung (Vergrößerung, 200-fach; Maßstabsbalken, 100 μm). b–d Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-KO-Mäuse (n = 3–5) wurden 8 Tage lang mit Vehikel oder 3 % DSS behandelt. Färbung der Ileumschleimhaut mit Alcianblau (Vergrößerung, 200-fach; Maßstabsbalken, 100 μm) und deren Quantifizierung (Vergrößerung, 200-fach; Maßstabsbalken, 100 μm) (b). Repräsentative Bilder der Darmschleimhautbakterien mittels Gram-Färbung (c) oder 16-rRNA-in-situ-Färbung (d) (Vergrößerung, 200×; Maßstab(e), 100 μm). Die Dicke der Schleimhautschicht wurde gemessen (rechte Grafik). Die Quantifizierungsanalyse wurde als Diagramme mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben mit Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Zusätzlich zur veränderten Barriere des Wirtsgewebes untersuchten wir die luminale Bakterienzusammensetzung als mögliche Ursache für die verschlechterte Darmbarriere, da Schleimhautmikroben die Synthese oder den Abbau der Schleimhautmatrix modulieren können. Insgesamt wurden 1.821.852 Paired-End-Reads aus den drei Bibliotheken mithilfe der Illumina iSeq-Plattform (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) erstellt. Anschließend wurden die 1.821.852 Single-End-Reads weiteren Analysen mit der QIIME2-Pipeline (Version 2021.2) unterzogen. Unter Verwendung des DADA2-Algorithmus wurden 2.012 repräsentative Sequenzen der V4-Region von 16 S-rRNA-Genen mit einer durchschnittlichen Länge von 151 bp über drei Bibliotheken hinweg konstruiert, darunter 100047,6, 102951,5, 100358,5 und 114681,25 durchschnittliche Merkmale im Wildtyp (Fahrzeug), Gdf15 KO (Fahrzeug), Wildtyp (CDDP) bzw. Gdf15 KO (CDDP). Alpha-Diversität basierend auf den Shannon-, Simpson- und Chao1-Metriken zeigte, dass der Grad der Diversität innerhalb jeder mikrobiellen Gemeinschaft ähnlich war (ergänzende Abbildung s4a). Im Gegensatz dazu unterschied sich die Beta-Diversität zwischen den Gemeinden erheblich (Ergänzende Abbildung s4b). Darüber hinaus zeigte die Zusammensetzungsanalyse der Phyla, dass Firmicutes und Bacteroidota in allen Proben die dominantesten Phyla waren (Ergänzende Abbildung s4c). Die Zusammensetzung unterschied sich zwischen den Proben, da Firmicutes als am häufigsten vorkommender Stamm in der Vehikel- bzw. CDDP-Gruppe 56,9 bzw. 59,6 % der Gesamtmerkmale ausmachten, wohingegen die relative Häufigkeit von Bacteroidota bei Gdf15-KO-Mäusen erhöht war (Ergänzende Abbildung s4a). Darüber hinaus betrug das Verhältnis der Proteobakterien als Reaktion auf die CDDP-Exposition bei Wildtyp-Mäusen das Neunfache seines ursprünglichen Wertes, wohingegen der CDDP-induzierte Anstieg der Proteobakterienhäufigkeit bei Gdf15-KO-Tieren marginal war (Ergänzende Abbildung s4c). Eine eingehende Untersuchung der Gemeinschaften auf Familien- oder Gattungsebene ergab, dass nicht klassifizierte Lachnospireae als Hauptfamilie des Stammes Firmicutes 25–32 % in jeder Gruppe beitrugen (Abb. 6a). Allerdings war Muribaculaceae die Hauptgattung im Stamm Bacteroidota bei den Gdf15-KO-Tieren. Eine weitere Bewertung wurde durchgeführt, um die relative Häufigkeit von Bakterien auf Artenebene als Reaktion auf einen Gdf15-Mangel einzustufen. Insbesondere erhöhte der Gdf15-Mangel die relative Häufigkeit von Muribaculum intestinale, Duncaniella dubosii, Akkermansia muciniphila, Lachnospiraceae_UCG-006, Prevotellaceae, Bacteroidesvulgatus und Dubosiella (Abb. 6b und ergänzende Abbildung s4d), die alle als Mucinglycan-Sammler identifiziert wurden menschliches Darmmikrobiom38,39. Darüber hinaus zeigte die metagenomische Vorhersage auf der Grundlage des Profils unter Verwendung von PICRUSt2 (Version 2.3.0) signifikante Erhöhungen der Gene, die für Enzyme im Zusammenhang mit dem Mucinabbau als Reaktion auf einen Gdf15-Mangel kodieren (Abb. 6c). Insbesondere erhöhte der Gdf15-Mangel die Expressionsniveaus der Gene für Sialat-O-Acetylesterase (EC:3.1.1.53), Arylsulfatase, N-Acetylgalactosamin-4-Sulfatase (EC:3.1.6.1) und Exo-Alpha-Sialidase (EC:3.1). 6.12), Beta-Mannosidase (EC:3.2.1.18), Alpha-L-Fucosidase (EC:3.2.1.25), Beta-N-Acetylhexosaminidase (EC:3.2.1.51) und Endo-Alpha-N-Acetylgalactosaminidase (EC). :3.2.1.52). Zusammengenommen erhöhte der Gdf15-Mangel gleichzeitig die Häufigkeit von Bakterien und Enzymen, die mit dem Mucin-Metabolismus in Zusammenhang stehen, und führte zu einer Störung der Schleimhautbarriere. Dies deutet darauf hin, dass Gdf15 dem durch Mikroben induzierten Mucin-Abbau entgegenwirkt.

Die Fäkalienbakterien wurden einer 16 S-rRNA-Analyse unterzogen, um die phylogenetische Zusammensetzung zu bestimmen. a,b Die Bakterien aller 30 am häufigsten vorkommenden Taxa werden zusammen mit der entsprechenden Häufigkeit (a) und der relativen Häufigkeit (b) aufgelistet. Neu markierte Mikroben sind wirksame Gattungen oder Arten, die Mucin fressen. c Gene im Zusammenhang mit Mucin-Abbauenzymen, rekonstruiert aus dem 16 S-rRNA-Profil mit PICRUSt2. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) (N = 3) mit allen Datenpunkten (Kreisen) dar (Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SD angezeigt. Sternchen (∗) zeigen signifikante Unterschiede zwischen Gruppen an (∗p < 0,05, ∗∗p). < 0,01, ∗∗∗p < 0,001). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

In Anbetracht der Gdf15-vermittelten Gegenwirkung gegen renointestinale Verletzungen wurde Autophagie als einer der repräsentativen Schutzmechanismen bewertet. Zunächst untersuchten wir die Beteiligung von Gdf15 am autophagischen Fluss in den Darm- und Nierenzellen mithilfe des Plasmids zur Expression von mCherry- und GFP-markiertem Mikrotubuli-assoziiertem Protein 1 A/1B-Leichtkette 3 B (LC3B), einem repräsentativen Autophagosomenmarker (Abb. 7a, b). Die Fusion von Autophagosomen mit späten Endosomen oder Lysosomen führt zu sauren Autolysosomen, bei denen das Signal des säureempfindlichen GFP verloren geht. Darüber hinaus geht das Signal des säureunempfindlichen mCherry letztendlich verloren, wenn das doppelt markierte Protein abgebaut wird. CP-infizierte Zellen zeigten eine Autophagosomenbildung (die gelben Puncta), gefolgt von einer Autolysosomenbildung (die roten) zur Clearance der ubiquitinylierten Proteine ​​unter chemischem Stress. Gdf15-defiziente Zellen zeigten jedoch Defekte im normalen autophagischen Fluss. Die Autolysosomenbildung wurde beim Abbau von Gdf15 erheblich beeinträchtigt, was zu einem verlängerten gelben Puncta-Signal mit abgeschwächten Mengen an roten Fluoreszenz-Puncta führte (Abb. 7a, b), was auf die entscheidende Rolle von Gdf15 bei der Erleichterung des autophagischen Flusses schließen lässt.

Kontroll- oder Gdf15-defiziente Zellen (HCT-8 (a) oder HK-2 (b) Zellen) wurden mit pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l Cisplatin (CP) behandelt. Die Zellen wurden unter dem konfokalen Mikroskop beobachtet, um den pH-responsiven autophagischen Fluss zu überwachen (Vergrößerung 400-fach; Maßstab(e) 10 μm). Die Quantifizierungsanalyse wurde als Diagramme mit Tukey-Whiskern (untere Diagramme) und allen Datenpunkten (Kreise) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben mit Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Als nächstes untersuchten wir den mechanistischen Zusammenhang zwischen Gdf15 und dem Schleimhautschutz. Dementsprechend wurde Autophagie als einer der schützenden Signalmechanismen gegen chemisch induzierte Mukositis bewertet. Wir stellten fest, dass Gdf15-Knockdown-Darmzellen eine verringerte Aktivierung von LC3B aufwiesen (Abb. 8a), was darauf hindeutet, dass Gdf15 die Autophagie positiv reguliert. Darüber hinaus haben wir p62 beobachtet, einen Rezeptor für Fracht, die durch Autophagie abgebaut werden soll, der an Ubiquitin und LC3 bindet und so die Clearance ubiquitinierter Proteine ​​im Autolysosom erleichtert. Obwohl p62 letztendlich in CP-exponierten Darmzellen abgebaut wurde, zeigten Gdf15-defiziente Zellen eine Resistenz gegen den CP-induzierten Abbauprozess. Unter Berücksichtigung des schleimhautvermittelten Darmschutzes zeigte die In-vitro-Bewertung mit menschlichen Darmepithelzellen eine Gdf15-abhängige Expression der Muzine 2 und 4 (Abb. 8b). Darüber hinaus schwächte die Hemmung des Autophagie-Signals die Mucin-2/4-Induktion als Reaktion auf CP-induzierten Stress ab, was darauf hindeutet, dass Gdf15-vermittelte Autophagie-Signale an der intestinalen Mucin-Expression beteiligt sind.

Mit Kontroll- oder shGdf15-Vektor transfizierte HCT8-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l Cisplatin (CP) behandelt. Zelllysate wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. b Mit Kontrolle (der negativen Kontroll-shRNA) oder shGdf15-Plasmid transfizierte HCT-8-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l CP in Abwesenheit oder Anwesenheit von 20 μmol/l 3-Methyladenin (3-MA) ​​behandelt Die mRNA-Spiegel von Mucin 4 oder Mucin 2 wurden mithilfe einer Reverse-Transkriptions-quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (RT-qPCR) gemessen. Die Datenwerte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) und alle Datenpunkte (Kreise) dargestellt. Sternchen (∗) weisen auf signifikante Unterschiede zur CP-behandelten Gruppe hin (∗∗∗p < 0,001). Boxed Blots zeigen die effiziente Unterdrückung von Gdf15 mithilfe von shRNA. c Clusterbewertung des Autophagie-Regulationsnetzwerks (ARN; https://autophagyregulation.org) als Reaktion auf Gdf15-Spiegel in menschlichen Zellen. Die Randdicke gibt den Grad der Betweenness-Zentralität jedes Knotens an. d Die mit Kontrolle (der Negativkontroll-shRNA) oder shGdf15-Plasmid transfizierten HCT-8-Zellen wurden 12 Stunden lang mit Vehikel oder 20 μmol/l CP behandelt und die mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR-Analyse gemessen. Die Datenwerte werden als Mittelwert ± SD und alle Datenpunkte (Kreise) dargestellt. Unterschiedliche Buchstaben über Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Um das detaillierte Signalnetzwerk zu untersuchen, das an der Gdf15-induzierten Autophagie beteiligt ist, führten wir eine systematische bioinformatische Analyse der Gdf15-Expression in menschlichen Zellen mithilfe der Datenbank des Autophagy Regulatory Network (ARN) durch, die verschiedene evidenzbasierte, mit der Autophagie-Maschinerie verbundene Komponenten, ihre Regulatoren, Transkriptionsfaktoren, miRNA-Regulatoren und Signalnetzwerkkonnektoren in mehrschichtiger Darstellung40. Basierend auf dem menschlichen Gdf15-responsiven Genprofil in Darmzellen identifizierten wir zwei Cluster rezeptorassoziierter Autophagie-Signale (Abb. 8c). Wir fanden heraus, dass Gdf15 das Gamma-Aminobuttersäure-Rezeptor-assoziierte Protein-ähnliche 1 (GABARAPL1) im Signalhierarchiesystem verstärkt, das die Signaltransduktion durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt und den Kernrezeptor-Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor Gamma (PPAR-γ) herunterreguliert. -reguliertes Transkriptionsnetzwerk. GABARAPL1 und PPAR-γ sind Schlüsselkomponenten mit hoher Betweenness-Zentralität von ARN als Reaktion auf Gdf15-Spiegel. Darüber hinaus trugen GABARAPL1-modulierte hochgradige Transkriptionsfaktoren wie Sp1 und das frühe Wachstumsreaktionsgen 1 (Egr1) zu Veränderungen des auf Gdf15 reagierenden Netzwerks bei. Darüber hinaus untersuchten wir Gdf15-regulierte kritische Module des Autophagie-Netzwerks in CP-exponierten menschlichen Darmzellen. Die Exposition des Darmepithels gegenüber CP erhöhte die GABARAPL1-Expression leicht, was durch Gdf15 positiv reguliert wurde (Abb. 8d). Im Gegensatz dazu regulierte chemischer Stress die Expression von PPARγ herunter.

Als nächstes wollten wir den Zusammenhang zwischen Autophagie und Nierengewebeschädigung vorhersagen. Obwohl die genaue Rolle der Autophagie bei Nierenerkrankungen weiterhin umstritten ist, weisen Patienten mit AKI tendenziell verringerte Werte von Beclin-1 (BEC1) auf, einem repräsentativen Autophagie-Biomarker (Abb. 9a). Die klinische Transkriptomanalyse ergab auch, dass Probanden mit hoher Gdf15-Expression dazu neigten, während einer akuten oder chronischen Nierenschädigung erhöhte BEC1-Spiegel aufzuweisen (Abb. 9b). Experimentell zeigten Gdf15-KO-Mäuse eine verringerte Expression von LC3B II, einem repräsentativen Autophagosomenmarker (Abb. 9c), was darauf hinweist, dass Gdf15 die Autophagie positiv reguliert. In Übereinstimmung mit den Expressionsniveaus im Nierengewebe schwächte der Gdf15-Knockdown in HK2-Zellen das Aktivierungsniveau von LC3B ab (Abb. 9d). Darüber hinaus zeigten Gdf15-defiziente Zellen erhöhte Konzentrationen von p62, einem Rezeptor für Ladung, die durch Autophagie abgebaut werden soll, was darauf hindeutet, dass Gdf15 sowohl zum Autolysosomenprozess als auch zur Autophagosomenbildung in den Nierentubulizellen beiträgt. Im Gegensatz dazu erhöhte die Gdf15-Unterdrückung den CP-induzierten Nierenzelltod (PARP1/2-Spaltung), was auf die schützende Wirkung von Gdf15 über Autophagie-Signale als Reaktion auf CP-Exposition hinweist. Darüber hinaus verschlimmerte die Hemmung des Autophagiesignals den CP-induzierten Nierenzelltod (Abb. 9e). Zusammengenommen bieten Gdf15 und sein nachgeschalteter Autophagieweg mechanistisch Schutz vor dem Tod von Nierenzellen.

a Expression von BECN1 bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718). b Basierend auf den Gdf15-Werten bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718, links) oder chronischer Nierenerkrankung (GSE66494, rechts) wählten wir die 20 Proben mit dem höchsten und 20 niedrigsten Wert aus, gefolgt von einem Vergleich der BECN1-Expressionswerte. Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern dargestellt. Die Sternchen (∗) geben signifikante Unterschiede zur Gruppe mit niedriger Expression an (∗p < 0,05 unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests). c Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-Knockout (KO)-Mäuse (n = 3–5) wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder Cisplatin (CP; 20 mg/kg) behandelt. Nierengewebelysate wurden einem Western Blot unterzogen. Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern dargestellt. Die Grafik zeigt die relativen Dichten der leichten Kette 3 B (LC3B) aus dem Western Blot. Unterschiedliche Buchstaben über Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05, n = 3). d Mit Kontroll- oder shGdf15-Vektor transfizierte HK-2-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l CP behandelt. Zelllysate wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Die HK-2-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Vehikel oder 10 μmol/l CP in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 μmol/l 3-Methyladenin (3-MA) ​​behandelt. Zelllysate wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15.

Schließlich verifizierte die klinische Transkriptomanalyse die Autophagie-Signalisierung bei Patienten mit akuter Nierenerkrankung. In Anbetracht der integrierten Stressreaktionen während einer Nierenschädigung war die durch PKR eIF2α-Kinase vermittelte Stresssignalisierung entscheidend an der Gdf15-Induktion während einer Nierenschädigung und CP-Exposition beteiligt (Abb. 1). Dementsprechend haben wir die GABARAPL1-Expression und die PKR-Spiegel bei Patienten mit AKI bewertet. Probanden mit erhöhten PKR-Spiegeln zeigten eine erhöhte GABARAPL1-Expression, was darauf hindeutet, dass ISR die GABARAPL1-Expression steigert (Abb. 10a). Darüber hinaus war PKR-responsives GABARAPL1 positiv mit verbesserten BECN1-Spiegeln verbunden, einem Autophagie-Biomarker in verletztem Nierengewebe (Abb. 10b). Darüber hinaus zeigten Patienten mit hohen Gdf15-Spiegeln tendenziell erhöhte GABARAPL1-Spiegel und eine verringerte PPARγ-Expression, was auf ein durch Gdf15 verändertes Autophagienetzwerk während akuter Nierenerkrankung hindeutet (Abb. 10c). Darüber hinaus ähnelte die klinische datenbankbasierte Vorhersage der regulatorischen Muster zweier wichtiger Autophagie-Netzwerkmoleküle, GABARAPL1 und PPAR-γ, denen, die in den CP-exponierten Nierentubuluszellen beobachtet wurden (Abb. 10d). Insgesamt modulierte das auf Stress reagierende Gdf15 das Autophagie-Signalnetzwerk und trug so zur Aufrechterhaltung der Schleimhautintegrität und des Überlebens der Nierenzellen in der gestörten Darm-Nieren-Achse bei (Abb. 10e).

a Basierend auf den Proteinkinase-R-Spiegeln (PKR) bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718) wählten wir die 20 höchsten und 20 niedrigsten Proben aus, gefolgt von einem Vergleich von Gamma-Aminobuttersäure-Rezeptor-assoziiertem Protein-like 1 (GABARAPL1). b Basierend auf den GABARAPL1-Spiegeln bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718) wählten wir die 20 höchsten und 20 niedrigsten Proben aus, gefolgt von einem Vergleich der BECN1-Expression. c Basierend auf den Gdf15-Werten wählten wir die 20 höchsten und 20 niedrigsten Proben aus, gefolgt von einem Vergleich der GABARAPL1- (links) und PPAR-γ-Expression (rechts) bei Patienten mit akuter Nierenschädigung (GSE30718). Die Ergebnisse werden als Diagramm mit Tukey-Whiskern und Ausreißern (orangefarbene Kreise) angezeigt. Die Sternchen (∗) geben signifikante Unterschiede zur Gruppe mit niedriger Expression an (*p < 0,05, **p < 0,01 unter Verwendung eines zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests). d Die mit der Kontrolle (der negativen Kontroll-shRNA) oder dem shGdf15-Plasmid transfizierten HK-2-Zellen wurden 12 Stunden lang mit Vehikel oder 20 μmol/l Cisplatin (CP) behandelt, und die mRNA-Spiegel wurden mithilfe einer quantitativen Polymerasekettenreaktionsanalyse mit umgekehrter Transkription gemessen. Die Datenwerte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt, und unterschiedliche Buchstaben über den Balken stellen signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen dar (p < 0,05). e Mechanistisches Schema des Gdf15-verknüpften Schutzes. Zellen aktivieren integrierte Stressreaktionen nach tubulären oder mukosalen Beleidigungen, was zur Produktion von Gdf15 führt. Das auf Stress reagierende Gdf15 spielt eine entscheidende Rolle bei der Neuorganisation des Autophagie-Regulationsnetzwerks für die endogene Anpassung, einschließlich der Produktion von intestinalem Mucin und dem Überleben der Nierenzellen vor zytotoxischen Verletzungen. Darüber hinaus wirkte das schutzgebundene Gdf15 der schleimabbauenden Mikrobiota im geschädigten Darm entgegen. Gdf15, Wachstumsdifferenzierungsfaktor 15; PPAR-γ, Peroxisom-Proliferator-aktivierter Gamma-Rezeptor.

In der vorliegenden Studie wurde Gdf15 als endogenes Anpassungsmolekül gegen pathologischen Stress evaluiert. Bemerkenswerterweise erleichterte ISR-aktiviertes Gdf15 den Zellschutz durch signalisierende Neuprogrammierung des Autophagie-Netzwerks als Reaktion auf Gewebeverletzungen. Zusätzlich zum Schutz der Nierenzellen war die Gdf15-verknüpfte autophagische Signalübertragung an der Aufrechterhaltung der Darmbarriere beteiligt, indem sie die Mucinproduktion gegen schleimabbauende Mikrobiota während der Nierenschädigung regulierte. Auf klinischen Datensätzen und Experimenten basierende Vorhersagen und Belege zum Gdf15-vermittelten Schutz liefern Einblicke in robuste Ziele für die molekulare Prävention oder Intervention gegen Darm- und Nierenschäden. Gdf15 wurde auch als früher Biomarker für verschiedene Gewebeverletzungen bewertet, der Entzündungen, Zellüberleben, Proliferation und Apoptose während des Fortschreitens der Krankheit reguliert41. Darüber hinaus wurden erhöhte Serumspiegel von Gdf15 mit einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten einer CKD in Verbindung gebracht, was insbesondere auf seine Nützlichkeit als Marker für Nierenfunktionsstörungen bei älteren und jungen Bevölkerungsgruppen hinweist25,42. Darüber hinaus können die Gdf15-Spiegel im Urin mit unerwünschten Folgen, Nierenhistologiemustern und der Notwendigkeit einer Nierenersatztherapie bei Patienten mit CKD43 in Verbindung gebracht werden. Berichten zufolge senkt eine Nierentransplantation die Serum-Gdf15-Spiegel, wohingegen sich herausstellte, dass eine Nephrektomie diese Spiegel hochreguliert, was darauf hindeutet, dass renales Gdf15 verschiedene physiologische Funktionen reguliert44. Hierin könnte ISR-gebundenes Gdf15 ein wertvoller prognostischer Biomarker für akute Nieren-Darm-Beschwerden sein, es sind jedoch zusätzliche Auswertungen erforderlich, um die Vorhersage auf verschiedene andere Nierenschäden zu verallgemeinern

Gdf15 erleichtert die Reorganisation von ARN als Reaktion auf zellulären Stress. Die mechanistischen Beweise für die Gdf15-vermittelte Regulierung der Autophagie sind jedoch nach wie vor begrenzt. Im Hinblick auf den indirekten Nachweis der Gdf15-Wirkung bei der Autophagie wurde gezeigt, dass Gdf15 in Kombination mit oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte autophagische Prozesse beeinträchtigt, indem es die Expression autophagierelevanter Proteine ​​in menschlichen Makrophagen während der Bildung atherosklerotischer Plaques reguliert45. Es wurde vorhergesagt, dass GABARAPL1 in der Autophagiemaschinerie ein schützender Signalmediator bei der PKR-verknüpften Nierenpathogenese nach Gdf15-Induktion ist. In Säugetierzellen werden Frachtmembranen von der Autophagie-bezogenen Protein-8-Familie erkannt und konjugiert, einschließlich GABARAPs oder LC3-Proteinen, die eine entscheidende Rolle im autophagischen Fluss spielen46,47. Obwohl LC3 an der Verlängerung der Phagophormembran beteiligt ist, sind GABARAPs, einschließlich GABARAPL1, für die Phagophorverlängerung und -versiegelung essentiell, was zur Reifung der Autophagosomen führt48. Darüber hinaus reguliert die GABARAP-Unterfamilie positiv ULK1 (Unc-like autophagy activating kinase1), eine wichtige auf Stress reagierende Kinase, die die Autophagiemaschinerie als Reaktion auf interne oder externe Stressfaktoren, einschließlich Nährstoff- und Stoffwechselstresssignalen, initiiert49. In der vorliegenden Studie war die auf Stress reagierende PKR- und Gdf15-Expression positiv mit der GABARAPL1-Expression bei Patienten mit akuter Nierenschädigung assoziiert, was die frühe Bildung und Reifung der Autophagie als schützenden Zellprozess gegen Nierentubulus- und Darmepithelverletzungen erleichtern könnte. Obwohl die Rolle der Autophagie bei Nierenschäden noch umfassend geklärt werden muss, kann eine frühe, auf Stress reagierende Autophagie mit einer adaptiven Reaktion verbunden sein, die den Zelltod unterdrückt und anschließend das Überleben der Nierentubuluszellen während einer Nierenschädigung verbessert50. Es ist bekannt, dass verschiedene Signalwege die mit der Autophagie verbundenen molekularen Wege beeinflussen. CP-induzierte pathologische Ergebnisse wurden bei akuten Nierenschäden negativ mit der Aktivierung der schützenden Autophagie über metabolische Reprogrammierungs-verknüpfte biochemische Signalmediatoren, einschließlich 5′-Adenosinmonophosphat-aktivierter Proteinkinase Alpha und Sirtuin-3, in Verbindung gebracht51,52. Darüber hinaus bindet die autophagische Maschinerie beschädigte Lysosomen in Nierenzellen, die durch die Bildung von Autophagosomen verschlungen werden, was während der AKI zu einer lysosomalen Homöostase und einer gesunden Zellintegrität führt53. Darüber hinaus spielt der mit der Autophagie verbundene intrazelluläre Abbauprozess eine entscheidende Rolle in Mucin-sezernierenden Darmzellen, um mit den entfalteten Protein-Stressreaktionen umzugehen54,55. Überschüssige Mengen an Mucin-Biosynthese mit defektem Autophagie-Signalweg können die intestinale Homöostase stören. Im Gegensatz zur schützenden Autophagie wurde die Autophagie-Signalisierung in einem Endotoxin-assoziierten Nierenschädigungsmodell mit schädlichen Auswirkungen über proinflammatorische Reaktionen in Verbindung gebracht56. Insbesondere kann die Autophagie Schutz vor einer leichten renalen Ischämie-Reperfusionsschädigung bieten; Dieser Effekt wird jedoch bei schweren Verletzungen nicht beobachtet57. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die anhaltende Aktivierung der Autophagie in den proximalen Nierentubuli die interstitielle Nierenfibrose in einem Mausmodell stimuliert58. Daher muss der genaue Beitrag von Nieren- und Darmzellen während der Autophagie je nach Schweregrad und Fortschreiten der Erkrankung gründlich beurteilt werden.

In der vorliegenden Studie wurde die Autophagie-Signalisierung mit PKR-vermittelter ISR im Modell der akuten Nierenschädigung unter CP-Behandlung in Verbindung gebracht. CP induziert Genotoxizität durch die Bildung von DNA-Addukten, die die genetische Replikation und zelluläre Stressreaktionen beeinträchtigen. CP-induzierte pathologische Folgen können jedoch mit mehreren Mechanismen verbunden sein, einschließlich der Blockade der RNA-Synthese oder ihrer direkten Bindung an RNA35,36,37. Es wurde festgestellt, dass CP-DNA-Addukte eine hohe Bindungsaktivität an Gruppendomänenproteine ​​mit hoher Mobilität aufweisen, wie z. B. den menschlichen Upstream-Bindungsfaktor, der die Bindung an den Promotor des ribosomalen RNA-Gens (rRNA) beeinträchtigen kann35,37. Darüber hinaus interkaliert CP direkt Ribosomen und mRNA, was zu einem ribosomalen Stillstand sowie einer unterdrückten globalen Translation führt36. Stressbedingter ribosomaler Stillstand löst eine durch eIF2α vermittelte globale Translationshemmung über PKR aus, einen primären biochemischen Weg in ISR27,59,60,61. PKR-verknüpfte ISR kann durch verschiedene interne und externe Stressfaktoren aktiviert werden, darunter Virusinfektion, spezifische Translationshemmung, oxidativer und ER-Stress, Wachstumsfaktormangel und bakterielle Infektion27,62. Insbesondere ist die ribosomale stressbedingte PKR-Aktivierung ein wirksamer Mechanismus, der bei entzündlichen und chronischen Erkrankungen über unausgeglichene Zytokin- und Wachstumsfaktorprofile beteiligt ist63,64,65. Darüber hinaus können PKR-bedingte Ereignisse eher mit generalisiertem pathologischem Nierenstress als mit chemikalienspezifischer Nierentoxizität verbunden sein, da Patienten mit AKI und CKD solche Zusammenhänge unabhängig von der Platinexposition aufwiesen (Abb. 1). Daher sind umfangreiche molekulare Belege erforderlich, um festzustellen, ob die auf Stress reagierende Signalübertragung unerwünschte Folgen begünstigt oder die biologische Homöostase bei verschiedenen Nierenverletzungen wiederherstellt.

Zusammenfassend konnte nachgewiesen werden, dass das auf Stress reagierende Gdf15 ein Anpassungsmolekül gegen akute Nieren-Darm-Verletzungen ist. Die Gdf15-Expression hing von der Signalaktivierung ab, die durch PKR-verknüpfte ISR vermittelt wurde, was durch klinische Transkriptomanalyse bei Patienten mit Nierenverletzungen bestätigt wurde. Insbesondere war das auf Stress reagierende Gdf15 an der Aufrechterhaltung der Integrität der Darmschleimhaut und der Nierenzellen beteiligt. Mechanistisch gesehen kontrollierte Gdf15 akute Nieren-Darm-Beschwerden, indem es die Muzinproduktion und den Zellschutz durch die Neuorganisation der zellschützenden autophagischen Signalübertragung erleichterte. Darüber hinaus wurde Gdf15 mit der Regulierung der schleimabbauenden Bakteriengemeinschaft in Verbindung gebracht. Insgesamt könnten auf Stress reagierende endogene Anpassungsreaktionen pathologischen Prozessen in der Signalachse des ISR-Gdf15-Autophagie-Netzwerks entgegenwirken und so eine neue Strategie für die Entwicklung prädiktiver Biomarker und Interventionen gegen Nieren-Darm-Beschwerden ebnen.

Die renale Genexpression wurde bei Patienten mit AKI (gse30718, n = 47) oder CKD (gse66494, n = 61) beurteilt. Die Genexpressionsanalyse menschlicher Nieren mit AKI ist begrenzt, da solche Nieren selten biopsiert werden66. Angesichts des begrenzten Angebots an Nierenbiopsieproben von Patienten mit AKI wurden Patienten mit Nierenexplantaten als Modelle für menschliches AKI weiterverfolgt66. Da bei allen Personen mit Nierentransplantation eine AKI auftritt, sind frühe Nierentransplantationen ohne Abstoßung ein hervorragendes Modell für eine AKI beim Menschen. Biopsien von Transplantaten mit AKI (gse30718) wurden mit denen aus den ursprünglichen Protokollbiopsien stabiler Transplantate verglichen.

Bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung kommt es zu einem irreversiblen und fortschreitenden Verlust von Nephronen, gefolgt von glomerulärer Fibrose, tubulärer Atrophie und tubulointerstitieller Fibrose, die häufig beobachtete Merkmale fortschreitender Nierenerkrankungen beim Menschen sind, unabhängig von der anfänglichen Ätiologie67. Biopsieproben von 48 Patienten mit histopathologisch bestätigter CKD (gse66494) wurden mithilfe zweier unabhängiger Entdeckungs- und Validierungsverfahren analysiert, um Gene zu identifizieren, die für tubulointerstitielle Fibrose und tubuläre Zellverletzungen verantwortlich sind67. Die Patienten wiesen verschiedene histologische Arten von Nierenerkrankungen auf, darunter IgA-Nephropathie (n = 15), membranöse Nephropathie (n = 7), Lupusnephritis (n = 6), nephrotisches Minimal-Change-Syndrom (n = 3) und membranoproliferative Glomerulonephritis (n = 3). ), Amyloidose (n = 3), antineutrophile zytoplasmatische Antikörper-bedingte Glomerulonephropathie (n = 2), diabetische Nephropathie (n = 2) und andere Nephropathien (n = 6).

In der vorliegenden Studie verwendeten wir die menschliche Darmepithelzelllinie HCT-8 und menschliche Nierenzellen (HK-2 und HEK293). Die mykoplasmenfreien Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection erworben und in RPMI 1640- oder DMEM-Medium (Welgene), ergänzt mit 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Welgene), 50 U/ml Penicillin, gehalten 50 µg/ml Streptomycin (Welgene) bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen in einer 60-mm-Schale ausgesät, und das Kulturmedium wurde aufgefüllt, als die Zellen Konfluenz erreichten. Nach 12-stündigem Auffüllen des Mediums wurde der Zellkultur 24 oder 48 Stunden lang CP (10 μmol/l) in normaler Kochsalzlösung zugesetzt. Anschließend wurden die Zellen zur Protein- und RNA-Extraktion geerntet. CP-Pulver wurde von Sigma-Aldrich (#PHR1624) gekauft und Stammlösungen wurden in normaler Kochsalzlösung hergestellt. Zellzahl und Lebensfähigkeit wurden mithilfe des Farbstoffausschlusstests mit Trypanblau-Farbstoff (Merck) mit einem Hämozytometer untersucht.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68. Im Einzelnen wurden C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alter Mann, Durchschnittsgewicht 16–18 g) von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) gekauft und Gdf15 KO C57BL/6-Mäuse wurden freundlicherweise von Dr. Se zur Verfügung gestellt -Jin Lee (Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA). Alle gleichaltrigen Mäuse wurden in einen Käfig gesetzt und ohne Voreingenommenheit nach dem Zufallsprinzip in verschiedene Käfige überführt. Mäuse wurden zufällig bestimmten Behandlungsgruppen zugeordnet. Die Mäuse wurden vor dem Experiment 14 Tage lang akklimatisiert und bei 22 ± 2 °C und 45–55 % relativer Luftfeuchtigkeit mit einem 12/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten. Drei Mäuse wurden pro Käfig gehalten und erhielten ausreichend Nahrung und Wasser in umweltgeschützten Käfigen, die aus einem transparenten Polypropylenkörper und einer oberen Abdeckung aus Edelstahl bestanden. Chemotherapie-induzierter AKI wurde durch eine intraperitoneale Injektion von Cisplatin (20 mg/kg) induziert. Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-KO-Mäuse wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder CP (20 mg/kg, intraperitoneal) behandelt (n = 4–5). Um DSS-induzierte Kolitis und Nierenkomplikationen auszulösen, wurden sieben Wochen alte männliche Mäuse acht Tage lang nach Belieben mit 3% DSS (Molekulargewicht 36.000–50.000 Da; MP Biomedical, Solon, OH, USA) im Trinkwasser behandelt. Zwei Tage später wurden die Mäuse unter tiefer Äthernarkose getötet.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Kurz gesagt, Nierenschnitte wurden mit PAS gefärbt und Mikrofotografien der vorbereiteten Schnitte wurden unter Verwendung eines Umkehrmikroskops (Nikon-Eclipse Ts2R, Tokio, Japan) angefertigt. Die erhaltenen Bilder wurden mit Adobe Photoshop CS6 und Multi Gauge V3.0 quantifiziert. Ein Teil der entnommenen Niere wurde in 4 % PFA bei 4 °C fixiert, in Paraffinwachs eingebettet und mit PAS gefärbt; Der andere Teil wurde zur RNA- und Proteinisolierung in zwei Portionen segmentiert, in flüssigem Stickstoff bei -120 °C für 10–15 Minuten eingefroren und am Tag der Organentnahme homogenisiert. Der Grad der Schädigung der Nierentubuli wurde als Anteil der beschädigten Nierentubuli ausgedrückt70. Für die statistische Analyse wurden die Gesichtsfelder jeder Probe zufällig ausgewählt, die Tubulus- und Lumendurchmesser unter dem Mikroskop fotografiert und die Läsionen mit der ImageJ-Software statistisch analysiert. Die Tubulusdurchmesser wurden von der Basalmembran über das engste Segment eines Tubulus bis zur Basalmembran auf der gegenüberliegenden Seite gemessen. Lumendurchmesser wurden durch Messung des Abstands zwischen den apikalen Membranen über den engsten Teil eines Tubulus bestimmt. Der Grad der tubulären Vakuolisierung wurde durch die Einstufung der Vakuolen bestimmt, die die proximalen Tubuli betreffen und sich bis zur Basalmembran erstrecken71. Der Zystenindex wurde als Prozentsatz der Zystenfläche im Verhältnis zur gesamten Nierenfläche berechnet72.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Für die Darmanalyse wurde der Dünndarm sofort entnommen, in Carnoy-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit Xylol entparaffiniert, mit einer Reihe abgestufter Alkohollösungen rehydratisiert und unter Verwendung eines etablierten Laborprotokolls mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um histopathologische Läsionen aufzudecken. Die Zotten- und Kryptalängen des Jejunums und Ileums wurden mit einem Mikrometer gemessen. Mindestens neun Zotten aus jedem Abschnitt wurden gemessen und für jede Gruppe gemittelt. Die morphologische Bewertung wurde blind anhand etablierter Kriterien durchgeführt. Kurz gesagt, H&E-gefärbte Querschnitte von Dünndarmgewebe wurden auf einer Skala von 0–4 bewertet, um den histopathologischen Schweregrad anhand der folgenden Kriterien zu bestimmen: 0, keine Veränderung gegenüber normalem Gewebe; Grad 1: leichte Entzündung in der Schleimhaut, hauptsächlich bestehend aus mononukleären Zellen, mit geringer Epithelschädigung; Grad 2: multifokale Entzündung, die einen Wert von Grad 1 übersteigt, mit mononukleären und wenigen polymorphkernigen Zellen (Neutrophilen), von der Basalmembran abgezogenen Gruftdrüsen, Mucindepletion aus Becherzellen und gelegentlichem Ablösen des Epithels von der Schleimhaut in das Lumen; Grad 3: multifokale Entzündung, die einen Wert von Grad 2 überschreitet, einschließlich mononukleärer Zellen und Neutrophilen, die in die Submukosa fortschreiten, Krypta-Abszesse mit erhöhtem Mucinmangel und Vorhandensein einer Epithelstörung; Grad 4: Fehlen von Krypten, schwere Schleimhautentzündung, die hauptsächlich aus Neutrophilen besteht, und kein Epithel mehr vorhanden oder vollständig abgelöst. Für jede Maus wurde der Durchschnitt von drei Sichtfeldern pro Dünndarmprobe untersucht. Alle Gutachter waren gegenüber den vorliegenden experimentellen Informationen blind.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Die vorbereiteten Gewebeschnitte wurden 10 Minuten lang in Xylol entparaffiniert, jeweils 3 Minuten lang in Ethanol (100, 90, 80, 70 und 50 %) rehydratisiert und dann 10 Minuten lang in destilliertes Wasser gelegt. AB 8GX-Lösung (1 % [Gew./Vol.] Alcianblau 8GX, Biosesang, Seoul, Korea) wurde 30 Minuten lang bei 25 °C auf die Schnitte aufgetragen und anschließend 2 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser gewaschen. Die Gegenfärbung erfolgte 5 Minuten lang mit 0,1 % (w/v) Nuclear Fast Red, gefolgt von einem 2-minütigen Waschen unter fließendem Leitungswasser. Anschließend wurden die gefärbten Schnitte in zwei Wechseln mit 95 %igem Ethanol und zwei Wechseln mit absolutem Alkohol dehydriert. Die getrockneten Schnitte wurden einige Minuten lang mit Xylol geklärt und dann mit einem synthetischen Eindeckmittel (Thermo Fisher Scientific, Seoul, Korea) fixiert.

Die Gram-Färbung wurde wie folgt durchgeführt45: Gewebeschnitte wurden in Xylol entparaffiniert, in Ethanol rehydratisiert, 5 Minuten in dH2O inkubiert, 1 Minute lang mit Kristallviolett gefärbt und dann unter Leitungswasser gewaschen. Anschließend wurden die Objektträger 1 Minute lang mit Gram-Jod gefärbt, unter Leitungswasser gespült, 5–10 Sekunden lang in 95 %igen Ethylalkohol getaucht und erneut unter Leitungswasser gespült. Die Objektträger wurden erneut 1–2 Minuten lang in Safranin gefärbt und unter Leitungswasser abgespült. Gefärbte Schnitte wurden in zwei Wechseln mit 95 %igem Ethanol schnell dehydriert, gefolgt von zwei Wechseln mit absolutem Alkohol, in Xylol geklärt und in einem synthetischen Einbettmittel (Thermo Fisher Scientific, Korea) montiert. Die Safranin-Färbung verfärbte gramnegative Zellen rot/rosa, während die grampositiven Bakterien blau blieben.

Der In-situ-Nachweis unter Verwendung von Sonden für 16 S-rRNA wurde wie folgt durchgeführt: Gewebe wurden mit Xylol entparaffiniert und durch einen Ethanolgradienten zu Wasser rehydratisiert. Die Schnitte wurden mit einer universellen Cy3-markierten Bakteriensonde, die gegen das 16 S-rRNA-Gen (5′-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′) gerichtet ist, über Nacht bei 50 °C inkubiert und zur Kernfärbung mit DAPI gegengefärbt.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68. Der Kreatininspiegel wurde mit dem Creatinine Serum Detection Kit (KB02-H2, Arbor Assays, MI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, Mäuse wurden mit 30 µl Isofluran (Hana Pharm Co., Seoul, Korea) anästhesiert und Blut wurde durch Durchführung einer retroorbitalen Sinuspunktion in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 10 µl 0,5 M EDTA gesammelt, das anschließend zentrifugiert wurde bei 1000 × g für 15 Minuten, um das Plasma abzutrennen, gefolgt von Lagerung bei –80 °C. Vor der Durchführung des Tests wurden alle Proben 15 Minuten lang bei 18.341 × g zentrifugiert. Anschließend wurden Standardlösungen (25 μl) mit bekannten Konzentrationen an Kreatinin-Stammlösung, Blutproben oder Wasser (Blindwert), verdünnt mit 25 μl Assay-Verdünnungsmittel, mit 100 μl DetectX-Kreatinin-Reagenz in einer 96-Well-Mikrotiterplatte gemischt und 30 Minuten lang inkubiert . Die optische Dichte wurde mit einem Mikroplattenlesegerät bei einer Wellenlänge von 490 nm gemessen. BUN wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Harnstoff-Stickstoff-Nachweiskits (KB024-H1, Arbor Assays) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, das erhaltene Plasma wurde 10 Minuten lang bei 18.341 × g zentrifugiert und in destilliertem Wasser (1:20) verdünnt. Anschließend wurden 50 µL Proben oder entsprechende Standards in Duplikaten in eine 96-Well-Platte pipettiert. Als nächstes wurden 75 µL der Farbreagenzien A und B mit einer Repetierpipette in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 30 Minuten lang bei 25 °C inkubiert und die optische Dichte wurde bei 450 nm gemessen.

Kurz gesagt, Nierenproben wurden in 1 ml modifiziertem Lysepuffer (1 % [w/v] Natriumdodecylsulfat [SDS], 1,0 mM Natriumorthovanadat und 10 mM Tris; pH 7,4) lysiert, der Edelstahlkügelchen (5 mm) enthielt. und 3 Minuten lang mit einem TissueLyser II (Qiagen) homogenisiert. Die Lysate wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 13.475 × g und 4 °C geklärt und unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA) quantifiziert. Gleiche Proteinmengen (30 μg) wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (8 % Gel für Anti-PARP 1/2, 15 % Gel für Anti-gespaltene Caspase-3) in einem Bio-Rad-Gel-Minielektrophoresesystem (Bio -Rad, Hercules, CA, USA). Die Proteine ​​wurden auf eine Polyvinylidendifluoridmembran (0,45 μm; EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) übertragen und dann 1 Stunde lang mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung plus 0,1 % Tween (TBST) blockiert. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit dem gewünschten Primärantikörper inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die Blots 2 Stunden lang mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Sekundärantikörper inkubiert und anschließend dreimal 30 Minuten lang mit TBST gewaschen. Die Antikörperbindung wurde unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenzsubstrats (ELPIS Biotech, Daejeon, Korea) nachgewiesen. Die folgenden Antikörper wurden für das Western Blot verwendet: monoklonales Maus-Anti-β-Actin (1:1000; SC4778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), polyklonales Kaninchen-Anti-PARP1/2 (1:1000; SC7150, Santa Cruz Biotechnology). ) und polyklonales Kaninchen-Anti-Gdf15 (Abclonal, Woburn, MA, USA). Die verwendeten Sekundärantikörper waren HRP-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, polyklonaler Antikörper (ADI-SAB-300-J, Enzo Biochem Inc. Farmingdale, NY, USA) und Ziegen-Anti-Maus-IgG (BML-SA204, Enzo Biochem Inc.). . Farmingdale, NY, USA).

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Gefrorene Gewebe wurden in 1 ml RiboEx-Lösung (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea), die Edelstahlkügelchen (5 mm) enthielt, 3–6 Minuten lang mit einem TissueLyser II (Qiagen) homogenisiert. Die Gesamt-RNA wurde mit RiboEx (GeneAll Biotech, Seoul, Südkorea) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend wurde RNA (500 ng) aus jeder Probe unter Verwendung eines TOPscript RT DryMIX cDNA-Synthesekits (Enzynomics, Daejeon, Korea) in cDNA transkribiert. cDNA wurde unter Verwendung von N-Taq-DNA-Polymerase (Enzynomics) in einem MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad) unter Verwendung der folgenden Parameter amplifiziert: Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 10 Sekunden, Glühen bei 60 °C für 15 s und Dehnung bei 72 °C für 30 s. Die folgenden Primer wurden für die PCR verwendet: menschliches GAPDH, 5'-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TT-3 'und 5'-CTG TGG TCA TGA GTC CTT CC-3'; menschliches MUCIN2, 5'-TTA CCC ACT GCG TGG AAG AC-3' und 5'-GCA TTC CCG TGA ACA CAC AC-3'; menschliches MUCIN4, 5'-GAC GAC TTC AGG ATG CCC AA-3' und 5'-AGG GCC AGG GTG TCA TAG AT-3'; menschliches Gdf15, 5'-ACG CTA CGA GGA CCT GCT AA-3' und 5'-AGA TTC TGC CAG CAG TTG GT-3'; menschliches GABARAPL1, 5'-AGG AGG ACC ATC CCT TTG AGT A-3' und 5'-TCC TCA GGT CTC AGG TGG ATT-3'; menschliches PPARγ, 5'-TTC AGA AAT GCC TTG CAG TG-3′ und 5′-CAC CTC TTT GCT CTG CTC CT-3′. Ein Aliquot jedes Polymerase-Kettenreaktionsprodukts (PCR) wurde einer 1,2 % (Gew./Vol.) Agarosegelelektrophorese unterzogen und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Für die Echtzeit-PCR wurde die cDNA mit SYBR Green (SG, TOPreal™ qPCR 2X PreMIX, Enzynomics) amplifiziert und mit Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: Denaturierung bei 94 °C für 2 Minuten , gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 10 s, Tempern bei 59 °C für 30 s und Verlängerung bei 98 °C für 45 s. Jede Probe wurde dreifach ausgewertet, um die statistische Robustheit sicherzustellen. Die relative Quantifizierung der Genexpression erfolgte mithilfe der vergleichenden Ct-Methode, bei der der Ct-Wert als der Punkt definiert wurde, an dem ein statistisch signifikanter Anstieg der Fluoreszenz beobachtet wurde. Für die Test- und Referenzreaktionen wurde die Anzahl der PCR-Zyklen (Ct) berechnet, die erforderlich sind, damit die Fluoreszenzintensitäten einen Schwellenwert unmittelbar über dem Hintergrundwert überschreiten. GAPDH wurde als interne Kontrolle für alle Experimente verwendet.

Mit pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT (ein Geschenk von Robin Ketteler, Addgene-Plasmid Nr. 123230, Watertown, MA, USA) transfizierte Zellen wurden verschiedenen Behandlungen ausgesetzt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und dann wurden die Deckgläser vorsichtig platziert und leichter Druck ausgeübt, um die verbleibenden Blasen zu entfernen. Konfokale Bilder wurden mit einem konfokalen Tischmikroskop Andor BC43 (Andor, Belfast, UK) bei Einzellinienanregung (529 nm für GFP oder 600 nm für mCherry) aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Fusion-Software (Andor) aufgenommen und mit der Imaris-Software (Andor) verarbeitet.

Die PPI-Netzwerkanalyse wurde unter Verwendung der Suchwerkzeuge zum Abrufen interagierender Gene (STRING) (https://string-db.org/) und ARN-Datenbanken durchgeführt, die verschiedene evidenzbasierte Autophagie-Maschinen-verknüpfte Komponenten, ihre Regulatoren und die Transkription abdecken Faktoren, miRNA-Regulatoren und Signalnetzwerkkonnektoren in mehrschichtiger Darstellung40. Die Betweenness-Zentralität des Knotens x wurde mithilfe der Funktion g(x) berechnet.

wobei \({{{{{{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\) die Gesamtzahl der kürzesten Pfade vom Knoten s zum Knoten t ist und \({{{{ {{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\left(x\right)\) ist die Anzahl der Pfade, die durch Knoten x verlaufen (nicht, wenn x ein Endpunkt ist).

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Acht Wochen alte Wildtyp- und Gdf15-KO-Mäuse wurden 72 Stunden lang mit Vehikel oder CP (20 mg/kg, intraperitoneal) behandelt (n = 4–5). Vor der Tötung der Tiere wurden Stuhlproben (5–6 Stück; 100 mg) gesammelt. Die gesammelten Stuhlproben wurden vor der DNA-Extraktion bei -150 °C gelagert. Mikrobielle DNA wurde aus 100 mg der Stuhlprobe mit dem Exgene Stool DNA Mini-Kit (GeneALL, Seoul, Korea) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert und gereinigt. Die extrahierte DNA wurde unter Verwendung eines Qubit-Fluorometers und eines hochempfindlichen dsDNA-Reagenzienkits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) quantifiziert.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Dreizehn DNA-Proben wurden als Behandlungsgruppen für die 16 S-Metagenombibliotheksvorbereitung zusammengefasst. Die V3–V4-Region des 16 S-rRNA-Gens wurde mit einem Primersatz (341 F, 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′; 805 R, 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) und Illumina-Sequenzierungsadaptern (Illumina Inc.) PCR-amplifiziert. ) unter Verwendung des KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA Biosystems, Wilmington, WA, USA) unter den folgenden Zyklusbedingungen: anfängliche Denaturierung 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 25 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Tempern bei 55 °C °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Nach der Amplikonreinigung mit AMPure® XP-Perlen (Agencourt Biosciences, Beverly, MA, USA) wurde die Bibliotheksgröße der PCR-Produkte mit einem BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) überprüft und die Menge mit einem Qubit gemessen Fluorometer. Das PCR-Amplikon wurde dann einer Indexierungs-PCR unter Verwendung des Nextera XT Index Kit (Illumina, Inc.) unterzogen. Die PCR-Zyklusbedingungen waren wie folgt: 3 Minuten lang bei 95 °C, gefolgt von acht Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 55 °C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden und einem Abschluss Verlängerung bei 72 °C für 5 Min. Die indizierten PCR-Amplikons wurden mit AMPure® XP-Perlen gereinigt, mit einem Bioanalysator auf Größe überprüft und mit einem Qubit-Fluorometer quantifiziert. Die quantifizierten Amplikons wurden auf 4 nM verdünnt und für die Sequenzierung auf einer Illumina iSeq-Plattform (Illumina, Inc.) gepoolt, wobei auf 2 × 150 bp Paired-End-Sequenzablesungen abgezielt wurde.

Das Verfahren basierte auf der zuvor veröffentlichten Methode68,69. Alle Sequenzen wurden qualitätsgefiltert und die Primer wurden mit Trimmomatic (v0.39)73 mit den folgenden Parametern getrimmt: LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36 SLIDINGWINDOW:4:15. Die Lesepaare, die den Qualitätsfilter bestanden haben, wurden mithilfe der Pipeline „Quantitative Insights into Microbial Ecology 2“ (QIIME2, v2020.2)74 weiter analysiert. Vierunddreißig Basen der umgekehrten Lesevorgänge wurden zur Qualitätsverbesserung mithilfe des DADA2-Algorithmus75 gekürzt. Die gelesenen Paare wurden dann verbunden, entrauscht und derepliziert, und Chimären wurden entfernt. Detaillierte Daten wurden verwendet, um auf ASVs zu verweisen. Repräsentative 16 S-rRNA-Sequenzen wurden taxonomischen Gruppen mithilfe des naiven Bayes-Klassifikators QIIME2 zugeordnet, der auf 99 % operativer taxonomischer Einheiten (OTUs) und der Primerregion aus der SILVA-rRNA-Datenbank (v138)76 trainiert wurde. Die taxonomische Klassifizierung wurde mit dem QIIME2-Taxon-Barplot-Plugin visualisiert. Repräsentative 16 S-rRNA-Sequenzen wurden einem maskierten Multisequenz-Alignment unter Verwendung von MAFFT77,78 unterzogen. Mit FastTree79 wurde ein phylogenetischer Baum erstellt. Mit dem R-Paket QIIME2R (v0.99.22) wurde eine Heatmap erstellt, die die prozentuale Häufigkeit von OTUs darstellt, deren relative Häufigkeit in jeder Stichprobe in den Top 30 lag. Ein phylogenetischer Baum basierend auf den zahlreichen OTUs wurde mithilfe des Neighbor-Joining-Algorithmus mit Jukes-Cantor-Korrektur unter Verwendung von MEGA X80 erstellt und visualisiert. Der 16 S-rRNA-Sequenzdatensatz wurde mit PICRUSt2 weiter analysiert, um Metagenom-assoziierte Funktionen wie Enzyme und Wege im Zusammenhang mit dem Mucin-Metabolismus vorherzusagen.

Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 6-Software (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Der Student-t-Test wurde für die vergleichende Analyse zweier Datengruppen verwendet. Um mehrere Gruppen zu vergleichen, wurden die Daten einer Varianzanalyse (ANOVA) mit der Newman-Keuls-Methode unterzogen, die als posthoc ANOVA-Bewertung durchgeführt wurde. Die Korrelationsanalyse nach Pearson wurde durchgeführt, um den Korrelationskoeffizienten (R) klinischer Datensätze zu bestimmen. Alle Auswertungen sind repräsentativ für zwei oder drei unabhängige Experimente. Einzelheiten zur Anzahl der biologischen Replikate und Tests finden Sie in den Abbildungslegenden.

Diese Tierstudie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Pusan ​​National University (PNU-IACUC, Busan, Korea) (PNU-2019-2365) genehmigt und gemäß der Deklaration von Helsinki und mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt Labortiere, wie sie von den National Institutes of Health der Vereinigten Staaten angenommen und veröffentlicht wurden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten. Die Daten sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich. Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Einige Daten sind aus Datenschutz- oder ethischen Gründen möglicherweise nicht verfügbar. Die unbeschnittenen Western Blots sind in der ergänzenden Abbildung s5 zu finden.

Unzutreffend.

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Wir schätzen die experimentelle Unterstützung bei der Tierbehandlung durch Kyung Hee Pyo (Pusan ​​National University, Yangsan, Korea) sehr. Diese Forschung wurde durch das Basic Science Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Bildungsministerium (2018R1D1A3B05041889), und im Rahmen eines internationalen Kooperationsprogramms, das von der National Research Foundation of Korea (NRF-2022K2A9A1A01098067) verwaltet wird , GJ2022). Die Arbeit von TK wurde vom UKRI BBSRC Gut Microbes and Health Institute Strategic Program BB/R012490/1 und seinen Teilprojekten BBS/E/F/000PR10353 und BBS/E/F/000PR10355 unterstützt. sowie ein UKRI BBSRC Core Strategic Program Grant for Genomes to Food Security (BB/CSP1720/1) und die zugehörigen Arbeitspakete BBS/E/T/000PR9819 und BBS/E/T/000PR9817.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Navin Ray, Seung Jun Park, Hoyung Jung.

Labor für Schleimhaut-Exposom und Biomodulation, Abteilung für Integrative Biomedizinische Wissenschaften, Pusan ​​National University, Yangsan, Korea

Navin Ray, Seung Jun Park, Hoyung Jung, Juil Kim und Yuseok Moon

Abteilung für Verdauungskrankheiten, Medizinische Fakultät, Imperial College London, London, Großbritannien

Tamas Korcsmaros

Earlham Institute, Norwich Research Park, Norwich, Großbritannien

Tamas Korcsmaros & Yuseok Moon

Quadram Institute Bioscience, Norwich Research Park, Norwich, Großbritannien

Tamas Korcsmaros

Graduiertenprogramm für genomische Datenwissenschaften, Pusan ​​National University, Yangsan, Korea

Yuseok Moon

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YM definierte das Projektdesign und die Hypothesen. NR, SJP und JK führten die Experimente durch und analysierten die Daten. HJ analysierte die Mikrobiomdaten. TK unterstützte die Netzwerkanalyse des ARN. YM hat das Manuskript erstellt und das Projekt betreut.

Korrespondenz mit Yuseok Moon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Stefan Reuter und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joao Valente. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ray, N., Park, SJ, Jung, H. et al. Auf Stress reagierendes Gdf15 wirkt der renointestinalen Toxizität durch Neuprogrammierung der Autophagie und der Mikrobiota entgegen. Commun Biol 6, 602 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1

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Eingegangen: 26. September 2022

Angenommen: 22. Mai 2023

Veröffentlicht: 03. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1

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