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Aug 02, 2023

Kommunikationsbiologie Band 6, Artikelnummer: 366 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Synaptische Plastizität beinhaltet die ordnungsgemäße Etablierung und Neuordnung struktureller und funktioneller Mikrodomänen. Dennoch erwies sich die Visualisierung der zugrunde liegenden Lipid-Hinweise als schwierig. Mithilfe einer Kombination aus schneller Kryofixierung, Membrangefrierfrakturierung, Immungoldmarkierung und Elektronenmikroskopie visualisieren und quantifizieren wir die Veränderungen und die Verteilung von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der Plasmamembran dendritischer Dornen und Teilbereichen davon ultrahohe Auflösung. Diese Bemühungen entschlüsseln verschiedene Phasen von PIP2-Signalen während der Induktion einer Langzeitdepression (LTD). Während der ersten Minuten steigt PIP2 in PIP5K-abhängiger Weise schnell an und bildet Nanocluster. PTEN trägt zu einer zweiten Phase der PIP2-Akkumulation bei. Die vorübergehend erhöhten PIP2-Signale sind auf die oberen und mittleren Wirbelsäulenköpfe beschränkt. Schließlich sorgt der PLC-abhängige PIP2-Abbau für die rechtzeitige Beendigung von PIP2-Hinweisen während der LTD-Induktion. Gemeinsam entschlüsselt diese Arbeit die räumlichen und zeitlichen Hinweise, die PIP2 in verschiedenen Phasen nach der LTD-Induktion setzt, und analysiert die molekularen Mechanismen, die der beobachteten PIP2-Dynamik zugrunde liegen.

Der Großteil der erregenden Postsynapsen im Zentralnervensystem befindet sich in kleinen dendritischen Vorsprüngen, den sogenannten dendritischen Stacheln. Synaptische Plastizitätsprozesse, die dynamische Veränderungen in der Struktur und Organisation dendritischer Stacheln beinhalten, liegen der Modulation der erregenden synaptischen Stärke zugrunde und gelten als Grundlage für Lernen und Gedächtnis1,2. Unter den Formen der synaptischen Plastizität ist ein Prozess namens Langzeitdepression (LTD) hervorzuheben, der die Empfindlichkeit und Reaktion auf ein bestimmtes synaptisches Signal verringert3. Auf molekularer Ebene beinhaltet LTD die Entfernung von Glutamatrezeptoren vom Typ α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) aus dem postsynaptischen Dichtegerüst durch Endozytose oder laterale Diffusion sowie strukturelle Umlagerungen der Aktin-Zytoskelett, was zu einem verringerten Wirbelsäulenvolumen3,4 führt.

In den letzten Jahrzehnten wurden große Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung der Proteinmaschinen erzielt, die die Plastizität der dendritischen Wirbelsäule steuern und vermitteln. Dennoch ist das Wissen über die Beteiligung von Membranlipiden – obwohl sie Hauptbestandteile der Membran sind – immer noch spärlich und oft umstritten oder sogar widersprüchlich5,6. Phosphoinositide sind dafür bekannt, dass sie mit verschiedenen Membranproteinen interagieren und diese regulieren und eine Vielzahl zellulärer Funktionen ausüben7. Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) und Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (hier der Einfachheit halber als PIP2 bezeichnet) sind die am häufigsten vorkommenden Phosphoinositide in Zellen. PIP2 ist an der Plasmamembran angereichert, wo es weniger als ein Prozent der Phospholipide ausmacht8. In Präsynapsen sind die entscheidenden Rollen von Phosphoinositiden gut belegt und umfassen hauptsächlich Membrantransportfunktionen9,10,11,12. Im Gegensatz dazu sind die physiologische Bedeutung und die spezifische Rolle von PIP2 in Postsynapsen weitaus weniger verstanden und umstritten.

Die Konzentrationen einzelner Phosphoinositide werden durch einen komplexen Satz spezifischer Lipidphosphatasen, Kinasen und Lipasen kontrolliert, die ihrerseits Ziele einer Vielzahl von Signalwegen sind13,14. Studien, die eine mutmaßliche Rolle von PIP2 insbesondere bei LTD untersuchten, stützten sich größtenteils auf die Manipulation dieser Stoffwechselenzyme und lieferten widersprüchliche Ergebnisse15,16,17,18,19,20. Die Gründe für die (offensichtlichen) Diskrepanzen können zu einem großen Teil in der Unfähigkeit liegen, PIP2 an postsynaptischen Dornen zu fixieren und direkt sichtbar zu machen, ohne seine Verteilung und seine ungestörte Verfügbarkeit als Lipid-Hinweis zu verändern.

Synapsen stellen besondere funktionelle und strukturelle Anforderungen an die Kompartimentierung, die durch unterschiedliche Membrannanodomänen festgelegt werden. Darüber hinaus erfordern diese Nanodomänen der synaptischen Membran die Fähigkeit, sich bei postsynaptischen Umlagerungen plastisch anzupassen. Um der Hypothese zu folgen, dass diese Umlagerungen während der LTD durch zeitliche und räumliche Hinweise des wichtigen Signalmoleküls PIP2 hervorgerufen werden könnten, verwendeten wir schnelle Kryofixierung, Membran-Gefrierfrakturierung, Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Visualisierung und quantitativen Bewertung die Verteilung von PIP2 in der Plasmamembran dendritischer Stacheln und in verschiedenen Unterbereichen davon mit ultrahoher Auflösung. Dadurch enthüllen wir die räumlichen und zeitlichen Hinweise, die PIP2 in verschiedenen Phasen nach der LTD-Induktion setzt, und analysieren die molekularen Mechanismen, die der beobachteten PIP2-Dynamik zugrunde liegen.

Frühere Studien, die versuchten, die Beteiligung von PIP2-Signalsignalen an dendritischen Wirbelsäulenmembranen während LTD aufzuklären, lieferten widersprüchliche Ergebnisse16,19. Da offensichtliche Diskrepanzen möglicherweise auf eine mangelnde Erhaltung der PIP2-Verteilung, auf eine künstliche PIP2-Löschung, auf eine unzureichende Auflösung und/oder auf andere Einschränkungen zurückzuführen sind, wollten wir eine Anti-PIP2-Immunmarkierung für schnell kryokonservierte gefriergebrochene Membranen einrichten mittels TEM analysiert. Liposomen mit entweder PIP2, Phosphatidylserin (PS), PI(3,4,5)P3 (PIP3) oder PI(3,4)P2 wurden in flüssigem, stickstoffgekühltem Propan/Ethan schnell eingefroren, gefriergebrochen und inkubiert mit Anti-PIP2- und goldgekoppelten Sekundärantikörpern, um zu untersuchen, ob es möglich sein könnte, das Signallipid PIP2 in einer Membranumgebung zu bewahren und nachzuweisen. Tatsächlich zeigten elektronenmikroskopische Untersuchungen von Liposomen mit zugesetztem PIP2 eine häufige Immunogold-Markierung (29,32 Goldpartikel/µm2), während dies bei Kontrollliposomen nicht der Fall war (Abb. 1a–d). Quantitative Auswertungen zeigten, dass Liposomen mit zugesetztem PIP2 eine mehr als 12-fach höhere Immunogold-Markierungsdichte aufwiesen als Kontrollliposomen, die lediglich einen Überschuss an nicht verwandten, negativ geladenen Lipidkopfgruppen in Form von PS-Zugabe aufwiesen (Abb. 1e; ergänzende Abb 1). Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass es grundsätzlich möglich ist, kryokonserviertes PIP2 in einer intakten Lipidumgebung nachzuweisen.

a Repräsentative TEM-Bilder von Anti-PIP2-Immunogold-markierten Gefrierbruchrepliken von Liposomen, bestehend aus 65 % (Gew./Vol.) PE, 30 % (Gew./Vol.) PC und 5 % (Gew./Vol.) von entweder PI(4, 5)P2 (PIP2) (a), PS (b), PI(3,4,5)P3 (PIP3) (c) oder PI(3,4)P2 (d). Pfeilspitzen markieren Beispiele für goldene Etiketten. Balken, 200 nm. e Quantitative Analysen der Markierungsdichten. PI(4,5)P2, n = 25; PS, n = 35; PI(3,4,5)P3, n = 21; PI(3,4)P2, n = 21 (für die Darstellung der quantitativen Daten in e als Balken-/Punktdiagramm siehe ergänzende Abbildung 1). f–o TEM-Bilder (f, f', f“, h–j, l–n) und quantitative Analysen (g, k, o) von Anti-PIP2-Immunogold-Markierungen von gefriergebrochenen Plasmamembranen von Soma (f, f ', f", g) und Dendriten (h–n) von Hippocampus-Neuronen (DIV14-16). Kontrolloberflächenbewertungen (E-Fläche, Eis) (g–k) und Kontrollexperimente mit Antikörpern, deren spezifische Bindung durch Vorinkubation mit PIP2-haltigen Liposomen (i, k) gelöscht wurde, zeigten die Spezifität der Markierung. (l–o) Zusätzliche quantitative Experimente mit unterschiedlichen Verdünnungen von Anti-PIP2-Antikörpern, wobei eine Antikörperverdünnung von 1:100 als Ergebnis für einen gesättigten PIP2-Nachweis ermittelt wurde. Balken, 200 nm. Soma P-Gesicht, n = 20; Soma E-Gesicht, n = 12; Eis, n = 14 ROIs. Dendriten: P-Fläche, n = 40; E-Gesicht, n = 37; Eis, n = 41; Quench (P-Fläche), n = 41 ROIs. Dendriten (P-Flächen), markiert mit verschiedenen Antikörperverdünnungen: 1:200, n = 78; 1:100, n = 78; 1:50, n = 82 ROIs. Daten, Mittelwert ± SEM von jeweils mindestens zwei unabhängigen Tests. Statistische Signifikanzberechnungen, einfaktorielle ANOVA/Tukey-Multi-Vergleichstest (g), Kruskal-Wallis/Dunn's (e, k, o). *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001. Für P < 0,0001 sind keine genauen P-Werte verfügbar. Andere P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Weitere Experimente zeigten, dass weder PIP3 noch PI(3,4)P2 von den Anti-PIP2-Antikörpern erkannt wurden (Abb. 1c, d). Die bei diesen beiden zusätzlichen Kontrollen beobachteten Markierungsdichten waren sehr niedrig und überstiegen nicht die von PS (Abb. 1e; ergänzende Abb. 1). Somit sind weder Inositide im Allgemeinen noch ein Phosphoinositid, das alle potenziellen antigenen Merkmale enthält, auch in PIP2 vorhanden, aber ein zusätzliches Phosphat (PIP3) bietet, oder ein Phosphoinositid, das alle Merkmale von PIP2 aufweist, aber eine Phosphatgruppe an einer anderen Position präsentiert (PI(3,4)) P2) wurden von den Anti-PIP2-Antikörpern erkannt. Der etablierte Immunnachweis war somit eindeutig spezifisch für PIP2.

Quantitative Bestimmungen der Markierungsdichten mit kolloidalen goldbeschichteten Sekundärantikörpern unterschiedlicher Größe zeigten, dass die Anti-PIP2-Immunmarkierung von gefriergebrochenen Membranen nicht stark von der Goldpartikelgröße abhängt (ergänzende Abbildung 2). Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, dass proteinbasierte Sonden an gefriergebrochenen Membranen nur geringe sterische Hinderungen aufweisen21.

Obwohl sie eine empfindliche Morphologie aufweisen, können auf Saphirscheiben gezüchtete kultivierte Neuronen im Prinzip kryokonserviert und gefriergebrochen werden, was die Immunogold-Markierung von membranassoziierten Proteinen wie dem F-BAR-Protein Syndapin I22,23 (PACSIN 1) und dem ermöglicht N-Ank-Protein Ankycorbin24 (RAI14). Primäre Rattenneuronen, die 16 Tage lang (DIV16) auf Saphir kultiviert wurden, zeigten normale postsynaptische Morphologien, einschließlich Dendriten, dendritischen Stacheln und deren Substrukturen22. Wir haben daher getestet, ob die Kombination aus Kryokonservierung, Gefrierfrakturierung, Immunogold-Markierung und TEM von Membranproteinen wesentlich auf den Nachweis des Signallipids PIP2 in seiner natürlichen, zellulären Membranumgebung ausgeweitet werden kann (Abb. 1f – k). Starke Vergrößerungen von gefriergebrochenen Plasmamembranbereichen des Somas zeigten häufige Anti-PIP2-Immunogold-Markierung (Abb. 1f–f"). Die Immunogold-Markierung wurde an verschiedenen Membrantopologien gefunden und war bis zu einem gewissen Grad geclustert. Die Markierungscluster Die nachgewiesenen Proben hatten normalerweise einen relativ einheitlichen Durchmesser von nicht mehr als 100 nm und enthielten maximal 10 Markierungen (Abb. 1f–f").

Die Markierung war hochspezifisch, da die P-Seite (protoplasmatische Seite der gebrochenen Plasmamembran) der Membran, die die zytosolische Grenzfläche darstellt, eine durchschnittliche Markierungsdichte von 24,2 Goldpartikeln/µm2 aufwies, während intrinsische Kontrolloberflächen innerhalb der Probe eine sehr geringe Markierung aufwiesen Dichten (Soma E-Fläche (exoplasmatische Fläche der gebrochenen Plasmamembran), 3,0/µm;2 Eis, 0,6/µm2) (Abb. 1g). Diese Beobachtungen stimmen damit überein, dass PIP2 überwiegend in der inneren Blättchenschicht der Plasmamembran vorhanden ist25.

Überraschenderweise lag die PIP2-Markierungsdichte der dendritischen Membranbereiche in denselben Proben und Immunmarkierungen weit unter der sehr häufigen Markierung in der somatischen Plasmamembran (Abb. 1h – k). In dendritischen Membranbereichen erreichte die Markierungsdichte nur 6,3 Partikel/µm2. Sie betrug daher nur etwa ein Viertel der somatischen Membranflächen.

Wichtig ist, dass auch dieser viel geringere dendritische PIP2-Nachweis eindeutig spezifisch war, da sowohl die dendritische E-Fläche als auch die Eisoberflächen nahezu keine Markierung zeigten. Darüber hinaus führten Antikörper-Quenching-Experimente mit PIP2-haltigen Liposomen auch zu einer sehr spärlichen Markierung gefriergebrochener dendritischer Plasmamembranen (Abb. 1i – k).

Um das Auftreten, die Intensität, die Dynamik und den Abfall von PIP2-Signalen zuverlässig mit ultrahoher Auflösung zu untersuchen, war es als nächstes wichtig, die Antikörperverdünnung zu bestimmen, um die maximale Menge an PIP2 ohne mutmaßliche unspezifische Bindung aufgrund eines Antikörperüberschusses nachzuweisen. Bei der Inkubation von Aliquots desselben Gefrierbruchreplikats mit unterschiedlichen Antikörperverdünnungen stellten wir fest, dass die Sättigung bei 1:100 erreicht wurde (Abb. 1l – o).

Die validierte und optimierte Anti-PIP2-Markierung ermöglichte uns als nächstes die Durchführung quantitativer ultrahochauflösender Untersuchungen der ungestörten PIP2-Lokalisierung in kryokonservierten und gefriergebrochenen Plasmamembranbereichen der dendritischen Laube reifer Hippocampus-Neuronen. Wie zuvor gezeigt, ist es prinzipiell möglich, nicht nur Dendriten, sondern auch dendritische Stacheln während der Gefrierfrakturierung und anschließenden Probenvorbereitung für die Elektronenmikroskopie zu erhalten und sie zu klassifizieren und den einzelnen Unterklassen zuzuordnen22. Wir haben unsere quantitativen Analysen auf pilzartige Stacheln konzentriert, d im Folgenden nur als Stacheln bezeichnet). Es stellte sich heraus, dass die filigranen dendritischen Stacheln, die aus Dendriten und ihren Unterstrukturen herausragen, mit ausreichender Geschwindigkeit gefrierten und mit Anti-PIP2-Immunmarkierung versehen waren (Abb. 2a – c). Quantitative Analysen zeigten, dass die Anti-PIP2-Immunmarkierungsdichte in den systematisch beprobten Stacheln (dh auch Nullprofile eingeschlossen) höher war (P = 0,0062) als die durchschnittliche Markierungsdichte benachbarter dendritischer Bereiche (Abb. 2d).

a–c TEM-Bilder (a, b) einer Anti-PIP2-Immunogold-markierten dendritischen Wirbelsäule eines gefrorenen Hippocampus-Neurons (DIV16) mit umrissener Wirbelsäule und transparenter Färbung des Dendriten (blau), der Wirbelsäulenbasis (grün) und des Wirbelsäulenhalses (gelb) und Wirbelsäulenkopf (rot) (a), wie schematisch in c dargestellt, und entsprechendes rohes TEM-Bild (b). Balken, 200 nm. d, e Quantitative Analysen der Anti-PIP2-Immunogold-Markierungsdichten von dendritischen versus dendritischen Plasmamembranbereichen der Wirbelsäule (d) bzw. von Subspinebereichen (e). Daten, Mittelwert ± SEM von 16 unabhängigen Tests; n = jeweils 159 ROIs (Dendriten, gesamte Wirbelsäule, Wirbelsäulenbasis, Hals und Kopf). Statistische Signifikanzberechnungen, Mann-Whitney (d) und Kruskal-Wallis/Dunn's (e). **P < 0,01; ****P < 0,0001. Für P < 0,0001 sind keine genauen P-Werte verfügbar. Der andere P-Wert ist in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Innerhalb der Wirbelsäule zeigte der Wirbelsäulenkopf eine starke Anreicherung von PIP2 über dem Hals und insbesondere der Basis (beide P < 0,0001; ****). Die durchschnittliche Anti-PIP2-Immunmarkierungsdichte in ruhenden Wirbelsäulenköpfen betrug 6,5 ± 0,6 Partikel/µm2, verglichen mit 2,9 ± 0,7 Partikel/µm2 und 4,6 ± 1,3 Partikel/µm2 in der Basis und im Nacken. Die Markierungsdichte von PIP2 in der Plasmamembran des Wirbelsäulenkopfes war somit mehr als doppelt so hoch wie in den Bereichen der Wirbelsäulenbasis. (Abb. 2e).

Diese auffälligen Unterschiede zeigten, dass selbst im Steady-State insbesondere die Köpfe der dendritischen Stacheln herausragende Bereiche der PIP2-Signale im dendritischen Dorn reifer Neuronen sind.

Induktion von LTD durch Inkubationen mit 50 µM N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) für bis zu 3 Minuten und präsynaptische Stummschaltung (2 µM Tetrodotoxin (TTX)-Vorinkubation)26,27,28,29,30,31 gefolgt von einem Chase Der Zeitraum in vorkonditioniertem Medium und das anschließende schnelle Einfrieren in bestimmten Zeiträumen zeigten, dass PIP2 sowohl in Dendriten als auch in dendritischen Stacheln vor und nach der LTD-Induktion nachgewiesen werden kann (Abb. 3a – h). Quantitative elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich die PIP2-Markierungsdichten in Dendritenbereichen (sogar in denen, die dendritische Stacheln umgeben) im Laufe der Zeit nicht signifikant veränderten (Abb. 3i), die Plasmamembran dendritischer Stacheln jedoch einen schnellen und statistisch hochsignifikanten Anstieg von PIP2 aufwies Dichte (P = 0,0049 (**)) 2 Minuten nach Beginn der NMDA-Stimulation. Die PIP2-Spiegel in dendritischen Stacheln erreichten während dieser ersten Phase 180 % der PIP2-Spiegel vor der LTD-Induktion durch NMDA (Abb. 3j).

a–h TEM-Bilder von Anti-PIP2-Immunogold-markierten dendritischen Stacheln (umrissen) von gefrorenen Hippocampus-Neuronen (DIV14-16) im Steady-State (0 Min.) und zu verschiedenen Zeiten während und nach LTD-Induktion durch Inkubation mit 50 µM NMDA für 3 Minuten und anschließendes Zurücksetzen in vorkonditioniertes Medium. Balken, 200 nm. i–k Quantitative Bestimmungen der Anti-PIP2-Immunogold-Markierungsdichten zu verschiedenen Behandlungszeiten während und nach der LTD-Induktion, bestimmt in Dendriten (i), in den Gesamtstacheln (j) und in den drei verschiedenen Spine-Subdomänen (k), ausgedrückt als Prozentsatz des Durchschnitts Markierungsdichte der gesamten Wirbelsäulendaten bei 0 Minuten (stationärer Zustand) in jedem Assay. Drei offensichtliche Phasen von PIP2-Signalantworten in dendritischen Stacheln während und nach der LTD-Induktion werden durch Färbung hervorgehoben (gelb, Phase 1, schneller erster Anstieg der PIP2-Dichte; grün, zweite Phase des Anstiegs von PIP2-Signalen in der Plasmamembran der Wirbelsäule (Kopf) bis). ein Maximum wird nach 10 min erreicht; blau, Phase 3, anschließend abnehmende PIP2-Signale in der Wirbelsäule (Kopf)). Für einen Vergleich der absoluten Daten für 0 und 3 + 7 Minuten, die nicht auf die jeweiligen Kontrollen normiert sind, mit entsprechenden Daten, die von einem unabhängigen, ungeschulten Experimentator erhalten wurden, siehe ergänzende Abbildung 3. (i – k) Daten, Mittelwert ± SEM. 0 Minuten, n = 159; 1 Minute, n = 36; 2 Minuten, n = 53; 3 Minuten, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) Minuten, n = 59; 15 (3 + 12) Minuten, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = jeweils 35 ROIs (Dendriten; gesamte Wirbelsäule; Wirbelsäulen-Subdomänen, Basis, Hals und Kopf) aus 3–16 unabhängigen Tests mit unterschiedlichen Inkubationszeiten. Statistische Signifikanzberechnungen, Kruskal-Wallis/Dunn's (i–k; **P < 0,01; ****P < 0,0001) und Mann-Whitney-Tests für 3 vs. 10 Min. und 10 vs. 30 Min. (j; ## P < 0,01) (j). Für P < 0,0001 sind keine genauen P-Werte verfügbar. Andere P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Auf diese erste Phase folgte ein zweiter, langsamerer Anstieg der PIP2-Spiegel, der 10 Minuten nach Beginn der LTD-Induktion seinen Höhepunkt erreichte. Über die gesamte Wirbelsäule hinweg war das Maximum dieser zweiten Phase durch PIP2-Signale gekennzeichnet, die mehr als doppelt so hoch (220 %) waren wie die PIP2-Werte im Steady-State (Abb. 3j). Dieses zentrale Ergebnis wurde anschließend durch zusätzliche Auswertungen eines unabhängigen Experimentators bestätigt. Wichtig ist, dass solche Bemühungen zu praktisch denselben Daten für die Auswahl der Wirbelsäule, die Bestimmung der Wirbelsäulenfläche und die Anzahl der Markierungen führten und daher auch praktisch identische Daten für die Markierungsdichten lieferten (ergänzende Abbildung 3).

Danach sanken die PIP2-Werte. Nach 30 Minuten erreichten sie nahezu das Vorbehandlungsniveau. Dieser Rückgang stellte somit eine weitere, dritte unterschiedliche Phase der PIP2-Signale bei LTD-Induktion in dendritischen Stacheln dar (Abb. 3j).

Interessanterweise ergaben detailliertere räumliche Untersuchungen, dass es ausschließlich die Wirbelsäulenkopfmembran, nicht aber die Membranbereiche der Wirbelsäulenbasis oder des Halses war, die den Anstieg der PIP2-Spiegel sowohl in Phase 1 als auch in Phase 2 aufwiesen, wenn sie auf die jeweiligen 0-Minuten-Daten normiert wurden ( Abb. 3k). In der Wirbelsäulenkopfmembran betrug die PIP2-Markierungsdichte in Phase 1 mehr als 230 % der Steady-State-Werte und in Phase 2 mehr als das Dreifache (Abb. 3k).

Sowohl die Wirbelsäulenbasis als auch die die Wirbelsäule umgebenden dendritischen Membranbereiche zeigten einen gewissen Trend zu einem Anstieg der PIP2-Spiegel, was auf eine gewisse 2D-Diffusion von PIP2 aus den Wirbelsäulenmembranbereichen während der späten Phase der LTD-Induktion hindeutet, aber beide Trends waren gering und blieben statistisch bestehen unbedeutend (Abb. 3i, k). Der allgemeine Rückgang der PIP2-Spiegel in der gesamten Wirbelsäule in Phase 3 (Abb. 3j) war hauptsächlich auf Veränderungen der PIP2-Spiegel im Wirbelsäulenkopf zurückzuführen. Dreißig Minuten nach Beginn der LTD-Induktion lagen die PIP2-Spiegel in den Wirbelsäulenkopfmembranen wieder auf dem Niveau vor der Behandlung (Abb. 3k).

Der Kopf der Wirbelsäule erfährt während der LTD verschiedene strukturelle Veränderungen, von denen angenommen wird, dass sie möglicherweise verschiedene Subdomänen der Wirbelsäule betreffen. Die Messung der Höhe jedes Wirbelsäulenkopfes und die Aufteilung in drei gleich breite Zonen (Abb. 4a) ergaben, dass die Verteilung der PIP2-Signale nicht gleich war, sondern sehr unterschiedliche Verhaltensweisen und Kinetiken in den drei Kopf-Subdomänen aufwiesen. Ein deutlicher PIP2-Anstieg nach NMDA-Behandlung konnte im Oberkopf beobachtet werden (Abb. 4b). Die PIP2-Signale stiegen in der ersten Phase schnell auf etwa 250 % derjenigen im Steady-State an. In der zweiten Phase stiegen sie weiter auf über 350 % an. Ein ähnlich starker Anstieg der PIP2-Spiegel wurde im mittleren Kopfbereich beobachtet (Abb. 4c; ergänzende Abb. 3k, l).

Die Wirbelsäulenköpfe wurden entsprechend der schematischen Darstellung (a) weiter in Unter-, Mittel- und Oberkopf unterteilt. Quantitative Analysen der PIP2-Markierungsdichten in DIV14-16-Neuronen nach NMDA-Behandlung (siehe Abb. 3) im oberen (b), mittleren (c) und unteren Kopf (d). Quantitative Analysen basieren auf den gesamten Wirbelsäulendaten bei 0 Minuten (stationärer Zustand) in jedem Assay. Für einen Vergleich der absoluten Daten für 0 und 3 + 7 Minuten, die nicht auf die jeweiligen Kontrollen normiert sind, mit entsprechenden Daten, die von einem unabhängigen, ungeschulten Experimentator erhalten wurden, siehe ergänzende Abbildung 3. 0 Minuten, n = 159; 1 Minute, n = 36; 2 Minuten, n = 53; 3 Minuten, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) Minuten, n = 59; 15 (3 + 12) Minuten, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = jeweils 35 ROIs (oberer, mittlerer und unterer Kopf) aus 3 bis 16 unabhängigen Tests mit unterschiedlichen Inkubationszeiten. Daten, Mittelwert ± SEM. Statistische Signifikanzberechnungen, Kruskal-Wallis/Dunn's. *P < 0,05; **P < 0,01. P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Die Kinetik der oberen Membranbereiche des Wirbelsäulenkopfes war einzigartig, da sie während der Phasen 1 und 2 einen relativ kontinuierlichen Anstieg der PIP2-Spiegel aufwies (Abb. 4b – d). Darüber hinaus erreichte der Abfall der PIP2-Spiegel in Phase 3 im Vergleich zu den Daten für das obere Membrankompartiment des Wirbelsäulenkopfes viel geringere Werte im mittleren und unteren Kopfbereich (Abb. 4b–d).

Diese Beobachtungen legen nahe, dass sich die LTD-assoziierte PIP2-Kinetik in den Unterkompartimenten der Wirbelsäulenköpfe unterscheidet. Die Zunahme der oberen und mittleren Membranbereiche des Wirbelsäulenkopfes spiegelt möglicherweise die Bedeutung von PIP2 für die Regulierung der Verfügbarkeit von AMPA-Rezeptoren am PSD und/oder die Auslösung struktureller Veränderungen im Wirbelsäulenkopf wider.

Es wurde vermutet, dass PIP2 an der Verankerung synaptischer AMPA-Rezeptoren und/oder an der Endozytose von AMPA-Rezeptoren beteiligt ist32. Bedauerlicherweise gelang die Etablierung doppelter Immunogold-Markierungen von AMPA- und/oder NMDA-Rezeptoren sowie von verschiedenen endozytischen Komponenten wie Clathrin und Dynamin sowie von postsynaptischen Gerüstproteinen wie PSD95 und ProSAP/Shank-Proteinen zusammen mit dem erfolgreichen PIP2 Die Erkennung war nicht erfolgreich. Im Einklang mit diesen Schwierigkeiten wurden sowohl NMDA- als auch AMPA-Rezeptoren auf der extrazellulären Seite nach der Membranherstellung nachgewiesen33,34,35,36,37 und es besteht die Schwierigkeit, Proteine ​​nachzuweisen, die nur indirekt oder nur peripher mit Membranen verbunden, aber nicht eingefügt sind wahrscheinlich aufgrund des Probenvorbereitungsverfahrens, das durch effektive Entfernung dieses Materials einen vollständigen Zugang zur Membran ermöglicht. Zellbiologische Prozesse, an denen die PIP2-Signalübertragung beteiligt ist, würden vermutlich auf einer Art PIP2-angereicherter Nanodomänen in den Wirbelsäulenmembranen beruhen. Tatsächlich konnten wir PIP2-Cluster in kryokonservierten, gefriergebrochenen Plasmamembranen kultivierter Neuronen beobachten (Abb. 5a).

ein Beispiel-TEM-Bild einer kryokonservierten, gefriergebrochenen und mit Anti-PIP2-Immunogold markierten Wirbelsäule eines primären Hippocampus-Neurons, das 3 Minuten lang mit NMDA behandelt wurde. Geclusterte (n ≥ 3 Goldpartikel in einem kreisförmigen ROI mit einem Durchmesser von 100 nm) und (mehr) disperse Anti-PIP2-Signale im Wirbelsäulenkopf sind mit Kreisen bzw. einer Pfeilspitze gekennzeichnet. Balken, 200 nm. b Quantifizierung der Verteilung von Anti-PIP2-Immunogold-Markierungen in Wirbelsäulenköpfen, die innerhalb eines Clusters gefunden wurden, im Vergleich zu Markierungen außerhalb eines Clusters (in Prozent der gesamten Markierung, die an der Spine-Head-Membran gefunden wurde). Beachten Sie den vorübergehenden Anstieg der Clusterbildung 2 und 3 Minuten nach Beginn der NMDA-Behandlung. Daten, Mittelwert ± SEM. 0 Minuten, n = 159; 1 Minute, n = 36; 2 Minuten, n = 53; 3 Minuten, n = 49; 5 (3 + 2) min, n = 50; 10 (3 + 7) Minuten, n = 59; 15 (3 + 12) Minuten, n = 44; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROIs (Wirbelsäulenkopf) jeweils aus 3 bis 16 unabhängigen Tests mit unterschiedlichen Inkubationszeiten. Zweifaktorielle ANOVA/Mehrfachvergleichstest nach Šídák (Vergleiche mit 0 Minuten). *P < 0,05; ***P < 0,001. P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Sowohl die Häufigkeit solcher Cluster als auch der relative Anteil an geclustertem PIP2 waren im Steady-State niedrig, stiegen jedoch stark an, wenn die Neuronen mit NMDA stimuliert wurden. Detaillierte quantitative Analysen der Wirbelsäulenköpfe ergaben, dass lediglich 22,4 % aller Anti-PIP2-Markierungen innerhalb von Clustern im Steady-State nachgewiesen wurden (Abb. 5b; 0 Min.). Im Gegensatz dazu wurden bereits 2 Minuten nach Beginn der NMDA-Behandlung 57,6 % aller PIP2-Markierungen innerhalb von Clustern gefunden (Abb. 5b; 2 Minuten).

Bemerkenswerterweise schien die PIP2-Clusterbildung hauptsächlich ein kurzlebiges und frühes Phänomen des schnellen PIP2-Anstiegs in Wirbelsäulenköpfen zu sein, da das statistisch signifikante und vorherrschende Auftreten von PIP2 innerhalb von Membran-Nanodomänen mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm (die meisten waren etwa 50 nm) vorkamen ) wurde ausschließlich 2 Minuten und 3 Minuten nach Beginn der LTD-Induktion beobachtet (Abb. 5b).

Erstaunlicherweise war das nun stark erhöhte PIP2 im Wirbelsäulenkopf (vergleiche Abb. 3k) nur wenige Minuten nach Abschluss der NMDA-Behandlung größtenteils dispers verteilt, ähnlich der Verteilung im Steady-State (Abb. 5b; vergleiche ähnliche Verteilung von). 0 Min. vs. 3 + 2 Min. bzw. 3 + 7 Min.). Auch die letzte Phase, die den Rückgang der PIP2-Spiegel nach LTD-Induktion widerspiegelt (15 und 30 Minuten), zeigte keine statistisch signifikante Veränderung der PIP2-Clusterbildung (Abb. 5b).

Die zweite Phase der LTD-induzierten PIP2-Signalübertragung, die durch die höchsten PIP2-Spiegel in dendritischen Wirbelsäulenköpfen gekennzeichnet ist (Abb. 3, 4), zeigte somit eine völlig andere Verteilung von PIP2 im Vergleich zur Anfangsphase der LTD-Induktion.

Es wurde gezeigt, dass Phosphatase und Tensin-Homolog, die auf Chromosom 10 (PTEN) gelöscht wurden, nach der LTD-Induktion in die PSD rekrutiert werden, und es wurde vermutet, dass PIP2-Signale während der LTD durch PIP3-Dephosphorylierung erzeugt werden17 (Abb. 6a). Bisperoxovanadium-Verbindungen hemmen Protein-Tyrosin-Phosphatasen, aber insbesondere bpV(HOpic) zeigte bei niedrigen Konzentrationen eine Selektivität für PTEN38. Um Einblicke in die molekularen Mechanismen hinter den PIP2-Ansammlungen in dendritischen Dornen zu erhalten, die wir in den verschiedenen Phasen der PIP2-Signale während der LTD-Induktion beobachteten, untersuchten wir daher Neuronen, die vor der LTD-Induktion mit NMDA 60 Minuten lang mit dem PTEN-Inhibitor bpV(HOpic) inkubiert wurden ( Abb. 6b–j).

ein Schema, das vorgeschlagene Wege zu PIP2 während LTD und der Hemmung durch bpV(HOpic) visualisiert. b–g Repräsentative TEM-Bilder von kryokonservierten, gefriergebrochenen und mit Anti-PIP2-Immunogold markierten Stacheln von DIV14-16-Hippocampus-Neuronen, die 60 Minuten lang mit ddH2O als Vehikelkontrolle (b–d) oder mit 15 nM bpV(HOpic) vorbehandelt wurden ) (e–g) und einer NMDA-induzierten LTD für 2 Minuten (c, f) und für 3 Minuten NMDA, gefolgt von einer 7-minütigen Nachinkubationszeit (d, g) im Vergleich zu nicht mit NMDA behandelten Kontrollen (0 Minuten) ausgesetzt. (Sei). Balken, 200 nm. h Quantitative Analysen der Anti-PIP2-Markierungsdichte in mit bpV(HOpic) vorbehandelten Neuronen im Vergleich zu den lediglich mit ddH2O behandelten Neuronen (−bpV(HOpic)) in denselben Tests zeigten keinen statistisch signifikanten Effekt der PTEN-Hemmung auf die basalen PIP2-Spiegel . Die Markierungsdichten wurden auf die jeweilige bpV(HOpic)-Kontrolle normalisiert. i, j Quantitative Analysen der PIP2-Signalübertragung während der ersten und zweiten Phase der LTD-Induktion in der gesamten Wirbelsäule (i) bzw. im Wirbelsäulenkopf (j) (beide normalisiert auf die jeweiligen 0-Minuten-Daten für die Markierungsdichten der gesamten Wirbelsäule von jedem der beiden Zustände, d. h. mit und ohne Inhibitor). Daten, Mittelwert ± SEM. −bpV(HOpic), 0 min, n = 39; 2 Minuten, n = 29; 10 (3 + 7) Min., n = jeweils 33 ROIs (gesamte Wirbelsäulen; Wirbelsäulenköpfe) und +bpV(HOpic), 0 Min., n = 33; 2 Minuten, n = 30; 10 (3 + 7) Minuten, n = jeweils 27 ROIs (Gesamtstacheln; Wirbelsäulenköpfe) primärer Neuronen aus 3 unabhängigen Tests. Mann–Whitney (h); Zweifaktorielle ANOVA/Bonferroni-Mehrfachvergleich zwischen ±bpV(HOpic)-Bedingungen (i, j). *P < 0,05. Zusätzliche Kruskal-Wallis/Dunn-Mehrfachvergleiche wurden zum Vergleich der + und −bpV(HOpic)-Daten nach 2 Minuten und nach 3 + 7 Minuten mit den Kontrolldaten (i, j) nach 0 Minuten durchgeführt. #P < 0,05; ##P < 0,01. P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Im Steady-State (0 min) führten Behandlungen mit bpV(HOpic) nicht zu signifikant unterschiedlichen PIP2-Werten in dendritischen Dornen im Vergleich zur Vorbehandlung mit Lösungsmittelkontrolle (ddH2O; −bpV(HOpic) (Abb. 6h). Auch der erhöhte PIP2 Die Werte der ersten Phase (dargestellt durch eine 2-minütige NMDA-Behandlung) blieben von der PTEN-Hemmung sowohl in den gesamten Plasmamembranbereichen der Wirbelsäule (Abb. 6i; 235 % des Steady-State; P = 0,0148) als auch in den Plasmamembranbereichen des Wirbelsäulenkopfes (Abb . 6j; 269 % des stationären Zustands; P = 0,0321).

Im Gegensatz zur bpV(HOpic)-unempfindlichen ersten Phase der PIP2-Dynamik der LTD-Induktion erwies sich die zweite Phase der PIP2-Dynamik (dargestellt durch 3 min NMDA + 7 min) als von der PTEN-Hemmung beeinflusst. Während die PIP2-Dichte in den Wirbelsäulenmembranen von Neuronen, die keiner PTEN-Hemmung ausgesetzt waren, 246 % der PIP2-Werte im Steady-State betrug und sich dadurch statistisch signifikant vom 0-Minuten-Wert (P = 0,0020) unterschied (Abb. 6i), waren die PIP2-Werte in der Die Plasmamembran dendritischer Stacheln von Neuronen, die mit PTEN-Inhibitor nach 3 + 7 Minuten vorinkubiert wurden, ähnelte eher den 0-Minuten-Daten (Abb. 6i).

Die hemmenden Wirkungen von bpV(HOpic) in der zweiten Phase der PIP2-Dynamik waren besonders deutlich in den Membranen des Wirbelsäulenkopfes. Hier waren die PIP2-Spiegel in nicht mit Inhibitor behandelten Kontrollneuronen nach 3 + 7 Minuten im Vergleich zu 0 Minuten stark erhöht (Abb. 6j; 297 %; P = 0,0131). Im Gegensatz dazu betrugen die PIP2-Spiegel in mit bpV(HOpic) vorbehandelten Neuronen nach 3 + 7 Minuten nur etwa 150 % der 0-Minuten-Daten und unterschieden sich dadurch statistisch signifikant von den etwa doppelt so hohen 3 + 7-Minuten-Daten, die im Wirbelsäulenkopf erhalten wurden Membranbereiche von Neuronen, die keiner PTEN-Hemmung ausgesetzt sind (Abb. 6j; P = 0, 0259).

Während also die Anfangsphase der PIP2-Signale bei der LTD-Induktion völlig unabhängig von der PIP2-Versorgung durch PIP3-Dephosphorylierung ist, trägt die enzymatische Aktivität von PTEN stark speziell zur zweiten Phase der LTD-vermittelten PIP2-Akkumulation in dendritischen Stachelköpfen bei.

In Eukaryoten wird PIP2 häufig durch Phosphorylierung von PI4P durch Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-kinasen (PI4P5Ks/PIP5Ks) erzeugt (Abb. 7a). Unter den verschiedenen Isozymen von PIP5K zeigt PIP5Kγ eine hohe Expression im Gehirn39. UNC3230 hemmte selektiv PIP5Kγ40 in Neuronen des Spinalganglions und ist der einzige kommerziell erhältliche Inhibitor von PIP5Ks. Wir haben daher UNC3230 verwendet, um die Quelle von PIP2 während der verschiedenen Phasen der PIP2-Signale während der LTD-Induktion weiter zu analysieren (Abb. 7b – g). Die 16-stündige Vorbehandlung von Hippocampus-Neuronen mit 500 nM UNC3230 führte im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle zu keinen statistisch signifikanten Auswirkungen auf die PIP2-Spiegel im Steady-State (t = 0 min) (Abb. 7h).

ein Schema, das vorgeschlagene Wege zu PIP2 während LTD und die Hemmung durch den PIP5K-Inhibitor UNC3230 visualisiert. b–g TEM-Bilder von dendritischen Stacheln von Anti-PIP2-immunmarkierten, gefrierfraktierten Stacheln von DIV14-16-Hippocampus-Neuronen, die mit Vehikelkontrolle (0,002 % DMSO) (−UNC3230, b–d) oder mit 500 nM UNC3230 vorbehandelt wurden ( e–g) entweder vor der Induktion von LTD durch 2 Minuten NMDA (50 µM) oder mit 3 Minuten NMDA und 7 Minuten Erholungszeit (3 + 7 Minuten) oder vor der Kryokonservierung der Zellen im Steady State (0 Minuten). Balken, 200 nm. h Quantitative Analysen der Anti-PIP2-Markierungsdichte von +UNC3230- und −UNC3230-Neuronen im Steady-State, normalisiert auf die jeweilige unbehandelte Kontrolle. i, j Quantitative Analysen der PIP2-Dynamik zeigen einen sehr starken negativen Einfluss der PIP5K-Hemmung sowohl auf die erste (2 Min.) als auch die zweite (3 + 7 Min.) Phase erhöhter PIP2-Signale während der LTD-Induktion. Daten, Mittelwert ± SEM. −UNC3230, 0 min, n = 62; 2 Minuten, n = 46; 10 (3 + 7) min, n = jeweils 35 ROIs (gesamte Wirbelsäulen; Wirbelsäulenköpfe) und + UNC3230, 0 min, n = 50; 2 Minuten, n = 40; 10 (3 + 7) Minuten, n = jeweils 34 ROIs (Gesamtstacheln; Wirbelsäulenköpfe) primärer Neuronen aus 3 unabhängigen Tests. Mann–Whitney (h; ns); Zweifaktorielle ANOVA/Bonferroni-Mehrfachvergleich zwischen ±UNC3230-Bedingungen (i, j) *P < 0,05; **P < 0,01. Zusätzlicher Kruskal-Wallis/Dunn-Mehrfachvergleich zum Vergleich von +UNC3230- und −UNC3230-Daten bei 2 Min. und 3 + 7 Min. bis 0 Min. Kontrolldaten (i, j)#.P < 0,05; ##P < 0,01. P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Im Gegensatz dazu führte die Hemmung von PIP5Kγ zu einer vollständigen Blockierung des PIP2-Anstiegs sowohl während der ersten (2 Minuten) als auch der zweiten Phase (3 + 7 Minuten) der PIP2-Dynamik während der LTD-Induktion. Dieser effiziente Block der LTD-induzierten PIP2-Akkumulation während beider Phasen wurde durch klare und statistisch signifikante Unterschiede zwischen den +- und −UNC3230-Bedingungen unterstrichen. Die vollständige Beeinträchtigung der LTD-induzierten PIP2-Dynamik in den dendritischen Stacheln war offensichtlich, unabhängig davon, ob die gesamte Wirbelsäule (Abb. 7i) oder ausschließlich die Membranbereiche des Wirbelsäulenkopfes untersucht wurden (Abb. 7j). Unter allen +UNC3230-Bedingungen blieben die PIP2-Werte gleich dem Steady-State (0 Minuten) (Abb. 7i, j).

Somit ist PIP5Kγ eindeutig von entscheidender Bedeutung bei der Erzeugung von PIP2 während der NMDA-induzierten LTD-Induktion, und im Gegensatz zum Phase-2-selektiven Beitrag von PTEN ist PIP5Kγ während der beiden Anfangsphasen der PIP2-Signale während der LTD-Induktion, die in identifiziert wurden, absolut entscheidend unsere quantitativen Analysen.

Um die LTD-induzierte PIP2-Dynamik in dendritischen Dornen zu verstehen, war es als nächstes wichtig, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die in Phase drei der PIP2-Dynamik während der LTD-Induktion zu einer wirksamen Entfernung von PIP2 aus dendritischen Dornplasmamembranbereichen führen. Neben der Diffusion von PIP2 aus den Bereichen des Wirbelsäulenkopfes katalysieren mehrere Enzyme Reaktionen, die PIP2 umwandeln. Vor allem Phospholipase C (PLC) spaltet PIP2 in Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) (Abb. 8a). Wir behandelten daher primäre Hippocampusneuronen mit dem PLC-Inhibitor U-7312241 im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (Dimethylsulfoxid (DMSO)) und untersuchten die PIP2-Spiegel mit und ohne LTD-Induktion (Abb. 8b – j). U-73122 führte weder zu Veränderungen der PIP2-Markierungsdichten vor der LTD-Induktion (Abb. 8h), noch veränderte es den schnellen Anstieg der PIP2-Spiegel während der Anfangsphasen der LTD-Induktion, selbst nach 10 Minuten (3 + 7 Minuten). ) Die PIP2-Spiegel blieben ähnlich denen von dendritischen Stacheln bzw. dendritischen Stachelköpfen, die nicht mit Inhibitor behandelt wurden (Abb. 8i, j).

ein Schema, das den Abbau von PIP2 zu DAG + IP3 und die Hemmung durch den PLC-Inhibitor U-73122 veranschaulicht. b–g TEM-Bilder von dendritischen Stacheln anti-PIP2-immunmarkierter, gefriergebrochener Stacheln von DIV14-16-Hippocampus-Neuronen, die lediglich mit Vehikelkontrolle (0,2 % DMSO) (−U-73122, b–d) oder mit 10 vorbehandelt wurden µM U-73122 (e–g) vor der Induktion von LTD durch 3 Minuten NMDA und 7 Minuten Erholungszeit (3 + 7 Minuten) bzw. durch 3 Minuten NMDA und 27 Minuten Erholungszeit (3 + 27 Minuten) oder vor dem Verlassen die Zellen im stationären Zustand (0 min). Balken, 200 nm. h Quantitative Analysen der Anti-PIP2-Markierungsdichte von +U-72122- und −U-73122-Neuronen im Steady-State, normalisiert auf die jeweilige unbehandelte Kontrolle. (i, j) Quantitative Analysen der PIP2-Dynamik zeigen, dass die PLC-Hemmung während der zweiten Phase (3 + 7 Minuten) der LTD-Induktion keinen Einfluss auf die PIP2-Spiegel hat, aber die Wiederherstellung der stationären PIP2-Spiegel während der dritten Phase (3) vollständig blockiert + 27 Min.) der PIP2-Dynamik während der LTD-Induktion. Daten, Mittelwert ± SEM. −U-73122, 0 min, n = 28; 3 + 7 Minuten, n = 27; 3 + 27 Min., n = jeweils 32 ROIs (gesamte Wirbelsäulen; Wirbelsäulenköpfe) und +U-73122, 0 Min., n = 27; 3 + 7 Minuten, n = 25; 3 + 27 Minuten, n = jeweils 26 ROIs (Gesamtstacheln; Wirbelsäulenköpfe) primärer Neuronen aus 3 unabhängigen Tests. Mann–Whitney (h; ns); Zweifaktorielle ANOVA/Bonferroni-Mehrfachvergleich zwischen ±U-73122-Bedingungen (i, j). *P < 0,05; **P < 0,01. Zusätzliche Mann-Whitney-Tests zum Vergleich von +U-73122- und −U-73122-Daten bei 3 + 7 Minuten und 3 + 27 Minuten mit Kontrolldaten bei 0 Minuten (i, j). #P < 0,05; ##P < 0,01; ###P < 0,001. P-Werte werden direkt in der Abbildung angegeben. Numerische Quelldaten finden Sie unter Ergänzende Daten 1.

Im Gegensatz dazu erwies sich die dritte Phase der PIP2-Signalisierung während der LTD-Induktion als vollständig abhängig von der PLC-Aktivität. Während nach 30 Minuten die Plasmamembranbereiche der dendritischen Wirbelsäule und die Kopfmembranbereiche der Wirbelsäule eine vollständige Umkehrung des vorübergehenden, LTD-induzierten PIP2-Anstiegs zeigten, blockierte die PLC-Hemmung mit U-73122 diesen Rückgang vollständig. Nach 30 Minuten blieben die Anti-PIP2-Markierungsdichten sowohl in den gesamten Plasmamembranbereichen der Wirbelsäule als auch in den Membranbereichen des Wirbelsäulenkopfes auf stark erhöhten Werten (Abb. 8i, j).

Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass LTD-induzierte PIP2-Signale in der dendritischen Wirbelsäulenkopfmembran durch den PIP2-Abbau durch PLC aktiv beendet werden. Insgesamt enthüllen unsere Daten damit einen vorübergehenden Anstieg von PIP2-Signalen in der Plasmamembran dendritischer Stacheln, verdeutlichen die Kinetik dieser Signale und entschlüsseln molekulare Mechanismen, die eine entscheidende Rolle bei der Dynamik von LTD-induzierten PIP2-Signalen in Membranbereichen der Wirbelsäulenköpfe spielen.

Von Phosphoinositiden ausgehende Signalsignale gelten als Schlüsselaspekte für eine Vielzahl zellulärer Funktionen. Allerdings sind diese zeitlichen und räumlichen Signale in Zellmembranen nur sehr schwer zu visualisieren und zu untersuchen. Hier beschreiben wir die unseres Wissens erste ultrahochauflösende Immunodetektion von PIP2. Unsere Analysen liefern die quantitativen räumlichen und zeitlichen Informationen über PIP2 in der Plasmamembran des postsynaptischen Kompartiments neuronaler Zellen, die erforderlich sind, um PIP2-Signalen in der synaptischen Plastizität zu folgen. Überraschenderweise ist das PIP2 im Vergleich zu den PIP2-Spiegeln, die in Plasmamembranbereichen des Somas von Neuronen gefunden wurden und mit reichlichen PIP2-Nachweisen unter Verwendung gereinigter GST-Fusionsproteine ​​der PH-Domäne von PLC in nicht-neuronalen Zellen übereinstimmten21,42,43 Die Konzentrationen in der Plasmamembran des Dendritenbaums waren im Allgemeinen sehr niedrig. Im dendritischen Kompartiment scheint PIP2 somit als echter Signalgeber zu fungieren.

Mithilfe von Lichtmikroskopie und der PIP2-löschenden PH-Domäne von PLC als Proteinsonde schlugen Horne und Dell'Acqua16 vor, dass PIP2 in dendritischen Stacheln im Vergleich zu Dendriten stark angereichert ist. Unsere quantitativen Bestimmungen zeigten, dass diese Anreicherung von PIP2 in dendritischen Stacheln im stationären Zustand durch die Verwendung von Gefrierfrakturierungsmethoden tatsächlich gering ist. Unsere elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergaben, dass ausschließlich die Wirbelsäulenkopfmembranen eine starke Anreicherung (ca. +40 %) gegenüber den allgemeinen Dendritenwerten aufwiesen.

Obwohl hochauflösende Methoden zum Nachweis von PIP2 in PC12-Zellen angewendet wurden44,45, ist die Lichtmikroskopie für detaillierte Korrelationen mit Substrukturen dendritischer Stacheln in neuronalen Zellen nur begrenzt nützlich, da diese Substrukturen sehr klein sind. Wichtig ist, dass die exogene Expression von Reporterproteinen wie PLC-PH, obwohl sie häufig als PIP2-Sonde verwendet werden, darüber hinaus nicht eindeutig Änderungen des PIP2-Spiegels meldet, da gezeigt wurde, dass PLC-PH durch die Zunahme des intrazellulären Abbauprodukts von PIP2 aus PIP2 verdrängt wird IP36,46. Diese Einschränkung ist schwerwiegend, da die Halbwertszeit von PIP2 in Zellen nur etwa 1 Minute beträgt47,48. Die PLC-PH-Expression beeinflusst darüber hinaus die Zellphysiologie und Signalübertragung, indem sie mit dem PIP2-abbauenden Enzym PLC konkurriert und PIP2-Signale unterdrückt49,50, da an PIP2 gebundenes PLC-PH mit der Bindung von PIP2-Effektorproteinen wie endozytischen, zytoskelettalen und anderen konkurriert Signalkomponenten7 und behindern dadurch die ordnungsgemäße Erkennung und Übertragung von PIP2-Signalen. Wichtig ist, dass auch chemische Fixierungsverfahren dazu neigen, die physiologische Verteilung von Lipidsignalen zu beeinträchtigen50,51. Die Kombination aus sehr schneller Kryokonservierung, Gefrierfrakturierung, irreversibler Stabilisierung von Membrankomponenten durch Kohlenstoff- und Platinverdampfung, Immunogold-Markierung der Membranreplik und TEM-Untersuchung überwindet alle diese früheren Einschränkungen und ermöglicht eine klare Sicht auf PIP2-Signale während der LTD.

Unsere quantitativen Bewertungen der relativen PIP2-Spiegel, -Verteilung und -Organisation sowie die verschiedenen Inhibitorstudien zeigen, dass die PIP2-Signalisierung während LTD in einem definierten Muster erfolgt. Erstens wurde ein rascher Anstieg der PIP2-Spiegel innerhalb der ersten 2 Minuten der LTD-Induktion durch NMDA-Anwendung beobachtet. In den Membranbereichen der Wirbelsäulenköpfe erreichte dieser erste Anstieg fast 250 % des Steady-State-Spiegels von PIP2. Eine Rolle von PIP2 bei der LTD-Induktion steht im Einklang mit der Erkenntnis, dass eine chemisch induzierte Dimerisierung zur Translokation des PIP2-abbauenden Enzyms Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase zur Plasmamembran und damit zur Abreicherung von PIP2 an der Plasmamembran zu einer Störung der LTD-Induktion führte Niederfrequenzstimulation19. Der von uns festgestellte beobachtete Anstieg von PIP2 während der frühen LTD-Induktion steht in scharfem Kontrast zu den Beobachtungen eines Abfalls der PIP2-Konzentration in dendritischen Dornen 1 Minute nach der NMDA-Stimulation16. Die jeweiligen widersprüchlichen Daten wurden jedoch mithilfe von Fluoreszenzmikroskopie und Überexpression von GFP-markiertem PLC-PH gewonnen und waren daher von allen oben bereits diskutierten technischen und wissenschaftlichen Einschränkungen betroffen. Der starke Anstieg der PIP2-Spiegel in der Plasmamembran dendritischer Dornen, den wir in unseren ultrahochauflösenden Studien an gefriergebrochenen Membranen beobachteten, war speziell auf Plasmamembranbereiche des Dornkopfes beschränkt. Dieser schnelle Anstieg von PIP2 im Wirbelsäulenkopf steht im Einklang mit einer Rolle von PIP2 bei der Induktion von LTD, da angenommen wird, dass LTD hauptsächlich Reorganisationen des Rezeptors und des Aktin-Zytoskeletts in den Wirbelsäulenköpfen beinhaltet1,2,3,4.

Bemerkenswerterweise waren die ersten Minuten der PIP2-Signale während LTD auch der einzige Zeitpunkt mit einer statistisch signifikanten Häufung von PIP2. PIP2-Cluster wurden bei Clathrin-vermittelter Endozytose beobachtet32. PIP2 bindet an verschiedene Proteine, die an der Endozytose beteiligt sind, und ist für die Initiierung und Aufrechterhaltung der Bildung endozytisch beschichteter Grübchen unerlässlich52,53,54,55,56,57,58,59. Die Anhäufung von PIP2 an entstehenden endozytischen Stellen kann die lokale Konzentration von Proteinen wie Epsin und BAR-Domänen enthaltenden Proteinen rekrutieren und erhöhen, die wiederum zur Membranverformung und zur Bildung endozytischer Vesikel beitragen60,61.

Die NMDA-vermittelte LTD-Induktion ist in den ersten Minuten nach der Stimulation durch AMPA-Rezeptor-Endozytose gekennzeichnet31,62,63 und es wird angenommen, dass diese Internalisierung vorzugsweise in perisynaptischen Bereichen auftritt63. Diese Beobachtungen stimmen sowohl mit dem von uns ermittelten Zeitrahmen der PIP2-Signale in dendritischen Stacheln als auch mit der in unseren weiteren Untersuchungen beobachteten Akkumulation und Beständigkeit stark erhöhter PIP2-Spiegel insbesondere in den oberen und mittleren Plasmamembranbereichen der Köpfe dendritischer Stacheln nach der LTD-Induktion überein detaillierte Analysen der Subdomänen der Wirbelsäulenmembran.

Unsere Inhibitorstudien zeigten, dass der schnelle PIP2-Anstieg während der anfänglichen LTD-Induktion fast ausschließlich durch PI4P verursacht wird. Dementsprechend wird angenommen, dass PIP5Kγ hauptsächlich für die Synthese von PIP2 an Synapsen verantwortlich ist64. Interessanterweise assoziiert dephosphoryliertes PIP5Kγ661 mit dem endozytischen Adapterkomplex AP265,66 und Neuronen, die eine Kinase-tote PIP5Kγ661-Mutante oder eine Mutante, die nicht in der Lage ist, mit dem AP2-Komplex zu assoziieren, exprimieren, zeigten nach LFS20 keine LTD.

Die zweite Phase der PIP2-Signale in dendritischen Stacheln während der LTD-Induktion war durch einen weiteren, aber weniger schnellen Anstieg der PIP2-Spiegel gekennzeichnet, der speziell auf die oberen und mittleren Plasmamembranbereiche des Wirbelsäulenkopfes beschränkt war. Auch hier hob die PIP5K-Hemmung durch UNC3230 diesen Zeitraum der PIP2-Dynamik auf. Darüber hinaus trug die PIP2-Erzeugung aus PIP3 zu den erhöhten PIP2-Spiegeln dieser Phase bei, wie durch PTEN-Hemmung unter Verwendung von bpV(HOpic) gezeigt wurde. Dieser Befund steht im Einklang mit den Beobachtungen, dass sich PTEN nach der NMDA-Inkubation an der PSD ansammelte und die Hemmung von PTEN durch bpV(HOpic) LTD in Hippocampus-Neuronen abschaffte17. Im Gegensatz dazu war die erste Phase der PIP2-Dynamik unempfindlich gegenüber der PTEN-Hemmung. Diese Ergebnisse unterstreichen deutlich die zweiphasige Natur des in dendritischen Wirbelsäulenköpfen während der LTD-Induktion beobachteten Anstiegs der PIP2-Spiegel.

Zeitliche Signalisierungsereignisse erfordern eine rechtzeitige Beendigung. Dies ist der Hauptaspekt der dritten Phase der PIP2-Dynamik, die etwa 10 Minuten nach der NMDA-induzierten LTD-Induktion beginnt. Nach etwa 30 Minuten konnten stationäre PIP2-Spiegel in dendritischen Stacheln beobachtet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zur Verwendung von überexprimiertem PLC-PH als PIP2-Sonde der direkte antikörperbasierte Nachweis von PIP2, den wir für unsere Analysen angewendet haben, nicht durch die Dissoziation von PIP2 aufgrund des IP3-Anstiegs beeinträchtigt wird. Der beobachtete Rückgang der Markierungsdichte spiegelt somit tatsächlich einen Rückgang von PIP2 in der Plasmamembran dendritischer Stacheln wider. Während Tendenzen leicht erhöhter PIP2-Spiegel in den Plasmamembranbereichen der Wirbelsäulenbasis und des umgebenden Dendriten auf einen gewissen Beitrag der PIP2-Diffusion aus den mit PIP2 angereicherten Membranbereichen des Wirbelsäulenkopfes hindeuten könnten, wurde der beobachtete Rückgang eindeutig durch einen aktiven Abbau von verursacht PIP2-Signale durch SPS, wie durch SPS-Hemmung mit U-73122 gezeigt. In Übereinstimmung mit einer gewissen Bedeutung von PLC bei LTD wurde beschrieben, dass die Anwendung von U-73122 LTD67 beeinträchtigt.

Es scheint denkbar, dass die beobachtete Verringerung der PIP2-Spiegel in späteren Stadien mit Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts zusammenhängt, die schließlich zu der bei LTD beobachteten Schrumpfung der dendritischen Wirbelsäulenköpfe führen. PIP2 kann den erforderlichen Aktin-Reorganisationen entgegenwirken und Aktinfilamente stabilisieren, da es beispielsweise die F-Aktin-trennende Aktivität von Cofilin68 und Gelsolin69 hemmt. PIP2 kann außerdem der Schrumpfung der Wirbelsäule entgegenwirken, indem es das Aktin-Zytoskelett mit der Plasmamembran verbindet70,71,72,73. Unsere Beobachtung, dass vorübergehend erhöhte PIP2-Spiegel 30 Minuten nach der LTD-Induktion Steady-State-Werte in dendritischen Wirbelsäulenkopfmembranen erreichten, stimmt zeitlich sehr gut mit der Beobachtung überein, dass es nach niederfrequenten Stimulationen von Hippocampusschnitten zu einer Verringerung des Volumens und Durchmessers des Wirbelsäulenkopfes kommen könnte 15–60 Minuten nach der Stimulation beobachtet werden74.

Insgesamt liefert diese Studie ultrahochauflösende Ansichten von PIP2 während der LTD-Induktion und entschlüsselt die räumlichen und zeitlichen Prinzipien und die molekularen Mechanismen, die den PIP2-Signalen und ihrer rechtzeitigen Beendigung während der LTD-Induktion in Subdomänen der dendritischen Wirbelsäulenmembran zugrunde liegen.

Liposomen wurden im Wesentlichen nach Reeves und Dowben75 hergestellt. Im Einzelnen wurden Lipidmischungen in Chloroform und Methanol (98:2 (v/v)) dünn auf dem Boden eines Fernbach-Kolbens verteilt. Die Mischungen bestanden aus 65 % (Gew./Vol.) Phosphatidylethanolamin (PE), 30 % (Gew./Vol.) Phosphatidylcholin (PC) und 5 % (Gew./Vol.) PIP2, PIP3, PI(3,4)P2 bzw. PS . Die Lipide wurden 30–60 Minuten lang unter einem stetigen Stickstoffgasstrom getrocknet und alle verbleibenden Lösungsmittel wurden durch eine einstündige Inkubation in einem Exsikkator entfernt. Anschließend wurden die Lipide 30–60 Minuten lang mit einem wassergesättigten Stickstoffstrom rehydriert, bevor 5 ml 0,3 M Saccharose in ddH2O zugegeben wurden, um eine weitere Hydratation und Ablösung der Liposomen aus dem Kolben für 14 Stunden bei 37 °C zu ermöglichen. Die die Liposomen enthaltende Suspension wurde dann 1 Stunde lang bei 28 °C und 200.000 × g zentrifugiert. Das Pellet mit den Liposomen wurde in 20 µl 0,3 M Saccharose in ddH2O mit einer Lipid-Endkonzentration von 8 mg/ml resuspendiert.

Die zur Gewinnung von biologischem Material verwendeten Ratten (Crl:WI; Charles River) wurden in der Tierversuchsanstalt des Universitätsklinikums Jena unter strikter Einhaltung der EU-Richtlinien für Tierversuche (genehmigt durch das Thüringer Landesamt, Bad Langensalza; Deutschland) gezüchtet. Da ausschließlich Primärzellen von postmortal trächtigen Ratten hergestellt wurden, war für diese Studie keine Genehmigung für Tierversuche erforderlich. Die für die Präparation primärer Hippocampusneuronen verwendeten Embryonen waren E18 und (unbestimmt) gemischten Geschlechts.

NIH3T3-Zellen wurden unter Standardbedingungen gehalten und kultiviert.

Primäre Hippocampus-Neuronen von Ratten (Crl:WI; Charles River) wurden weitgehend nach den von Banker und Cowan76 entwickelten und zuvor etablierten Prinzipien23 präpariert und kultiviert. Im Detail wurden Gehirne von E18-Ratten in eiskaltem HBSS (Invitrogen) präpariert. Isolierte Hippocampi wurden dann mit 0,05 % Trypsin/EDTA (Invitrogen) 15 Minuten lang bei 37 °C trypsiniert. Der Überstand wurde gegen Neurobasalmedium (Invitrogen) ausgetauscht und mit B-27-Ergänzung (Invitrogen) und 0,5 mM L-Glutamat ergänzt. Das Gewebe wurde dann durch sorgfältiges Verreiben mit einer 1-ml-Pasteurpipette in einzelne Zellen dissoziiert.

Als Vorbereitung für die Gefrierfrakturierung mussten Neuronen in 24-Well-Platten mit Saphirscheiben kultiviert werden (Rudolf Brügger, Swiss Micro Technology)22,23. Zur Vorbereitung wurden Saphirscheiben sorgfältig gereinigt und gewaschen und anschließend über Nacht bei 37 °C mit Poly-D-Lysin beschichtet. Das Poly-D-Lysin wurde abgesaugt und durch dreimaliges 10-minütiges Waschen mit ddH2O vorsichtig entfernt. Anschließend wurden die Saphirscheiben getrocknet und 15 Minuten lang mit ultraviolettem Licht bestrahlt.

Primäre Neuronen wurden mit einer Dichte von 80.000 Zellen pro Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen gesät, die mit den vorbereiteten Saphirscheiben ergänzt war. Die primären Hippocampus-Neuronen wurden dann etwa 2 Wochen lang in NeurobasalTM-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 1 × B27 und Penicillin/Streptomycin (100 U bzw. 100 µg pro ml) kultiviert (bei 37 °C, 90 % Luftfeuchtigkeit). und 5 % CO2). Bei DIV14-16 auf Saphir hatten Neuronen Synapsen und neuronale Netzwerke22 gebildet und wurden dann für die Experimente verwendet.

LTD wurde mit NMDA26,31 induziert. Im Detail wurden Hippocampus-Neuronen durch eine Vorinkubation mit 2 µM TTX (60 Minuten) präsynaptisch zum Schweigen gebracht, bevor LTD mit 50 µM NMDA für bis zu 3 Minuten induziert wurde, gefolgt von einer Chase in vorkonditioniertem Medium für bestimmte Analysezeitpunkte.

Um die Wege zu untersuchen, die während der LTD-Induktion vorübergehend PIP2 bereitstellen und zu einem Rückgang der PIP2-Spiegel zu späteren Zeitpunkten führen, wurden vor der NMDA-Behandlung Inhibitoren oder ihre entsprechende Lösungsmittelkontrolle zugesetzt. Die Endkonzentrationen und Vorinkubationszeiten waren wie folgt: bpV(HOpic), 15 nM in ddH2O für 60 Minuten; U-73122, 10 µM für 60 Minuten in 0,2 % (v/v) DMSO; UNC3230 bei 500 nM für 16 Stunden in 0,002 % (v/v) DMSO.

Zur Gefrierfrakturierung wurden Kupferprofile (0,6 mm hoch) verwendet. Vor ihrer Verwendung wurden die Profile in einem Ultraschallbad mit 4 % (w/v) Weinsäure gereinigt, in reinem Aceton gewaschen und anschließend in reinem Methanol gelagert.

Für die Gefrierfrakturierung von Liposomen wurden 2 µl der Liposomenlösung mithilfe der Sandwich-Doppelrepliktechnik77 auf zwei Kupferprofile verteilt. Das Sandwich wurde sofort in flüssigem Propan/Ethan (1:1) tauchgefroren und in flüssigem Stickstoff abgekühlt (Abkühlrate >4000 K/s)78.

Drei Sandwiches wurden in einen ebenfalls in flüssigem Stickstoff gekühlten Doppelreplika-Probentisch gelegt. Anschließend wurden die Proben in eine auf –140 °C gekühlte Gefrierbruchmaschine BAF400T (Leica) überführt. Nachdem das Vakuum aufgebaut war und der Druck nicht mehr als 10–6 mbar betrug, wurde der Tisch aufgeklappt, sodass die beiden Sandwichprofile mit der Probe dazwischen getrennt und die Probe gefriergebrochen wurde. Sofort wurde eine Kohlenstoffschicht von 15–20 nm in einem 90°-Winkel auf die Proben aufgedampft, gefolgt von einer etwa 2 nm dicken Platin/Kohlenstoff-Schicht in einem 35°-Winkel78. Die Proben wurden aus der Gefrier-Bruch-Maschine entnommen, aufgetaut, auf 2,5 % (w/v) SDS geschwommen und unter leichtem Schütteln über Nacht bei RT inkubiert.

Nach dreimaligem 10-minütigem Waschen in PBS wurde jegliche unspezifische Bindung durch Inkubation in 1 % (Gew./Vol.) BSA, 0,5 % (Gew./Vol.) Fischgelatine, 0,005 % (V/V) Tween® 20 in PBS (pH-Wert: 7.2) (LBB) für 30 Min. bei RT. Die Replika wurden dann über Nacht bei 4 °C mit monoklonalen Maus-Anti-PIP2-Antikörpern (Enzo Life Sciences) in LBB (Standardbedingung, 1:100, d. h. 10 µg/ml) inkubiert. Ungebundener Primärantikörper wurde durch dreimaliges Waschen mit LBB (jeweils 10 Minuten) entfernt. Die Proben wurden dann 2 Stunden lang in goldpartikelgebundenen Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörpern, verdünnt in LBB (bei RT) (5, 10 und 15 nm Gold; BBI Solutions), inkubiert. Ungebundener Sekundärantikörper wurde durch Waschen (3 × 10 Minuten) mit PBS entfernt. Die immunmarkierten Replikate wurden dann 10 Minuten lang mit 0,5 % (v/v) Glutaraldehyd in PBS fixiert, zweimal 10 Minuten lang mit ddH2O gewaschen, auf unbeschichtete Kupfergitter montiert und getrocknet.

Für die Gefrierfrakturierung von NIH3T3-Zellen77,78 wurde eine Suspension der Zellen zwischen zwei Kupferprofilen platziert, ähnlich wie oben für die Analyse von Liposomen beschrieben, und dann wie oben beschrieben gefriergebrochen und immunmarkiert.

Für neuronale Gefrierbruchexperimente22,23,24 wurden Neuronen auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Saphirscheiben gezüchtet (siehe oben). Die Saphirscheiben wurden auf 0,8 mm hohe Kupferprofile gelegt, damit sie in den Doppelreplika-Probentisch passten. Zwischen den Sandwichteilen wurde ein Tropfen 20 % (Gew./Vol.) BSA hinzugefügt, um Gefrierartefakte zu vermeiden. Anschließend wurde die Gefrierfrakturierung und Immunmarkierung wie oben beschrieben durchgeführt.

Die Replikate wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop EM902A (Zeiss) untersucht, das bei 80 keV betrieben wurde.

Die Bildaufnahme erfolgte mit einer 1-k-FastScan-CCD-Kamera (TVIPS-Kamera und Software). Die Bilder wurden mit der EM-Menu 4-Software (TVIPS)22,23,24 digitalisiert.

Die Nachweisbarkeit von PIP2 in Membranen durch Anti-PIP2-Antikörper wurde erstmals mit PIP2-haltigen Liposomen untersucht. Als Kontrollen wurden Liposomen untersucht, die PIP3, PI(3,4)P2 bzw. PS anstelle von PIP2 enthielten. Die Bilder wurden per Zufallsstichprobe aufgenommen, d. h. unabhängig von der PIP2-Kennzeichnung und unter Einbeziehung von Nullprofilen. Gleiches gilt für die Bildgebung von NIH3T3-Zellmembranen.

Anti-PIP2-Immunmarkierungsspezifitätsbestimmungen mit gefriergebrochenen Membranen von Neuronen wurden mit Neuronen des Hippocampus von Ratten bei DIV14–16 und einer systematischen Probenahme über die Gitter hinweg durchgeführt. Flächen aller drei Kategorien (Eis und E-Fläche als Kontrollen versus P-Fläche) wurden gemessen, die Menge an Goldpartikeln pro Fläche gezählt und die Markierungsdichten (bestimmt als Partikel pro µm2) verglichen, um die Antikörperspezifität zu testen.

Als zusätzliche Kontrollen dienten sekundäre Antikörperkontrollen und gefriergebrochene Proben, bei denen die primäre Antikörperbindung durch Vorinkubation des Antikörpers mit Liposomen mit zugesetztem PIP2 gelöscht wurde.

Zusätzliche quantitative Experimente mit unterschiedlichen Verdünnungen von Anti-PIP2-Antikörpern (1:200, 1:100, 1:50 entsprechend Konzentrationen von 5, 10 und 20 µg/ml) wurden verwendet, um eine Antikörperverdünnung zu ermitteln, die einen gesättigten PIP2-Nachweis liefert.

Vor der Visualisierung durch TEM wurden die Proben von einem Kollegen geblendet. Die Blendung der aufgezeichneten Bilder erfolgte mit der Ant Renamer-Software (antp.be/software/renamer). TEM-Bilder wurden durch systematisches Screening der Gitter erhalten.

Bilder von gefriergebrochenen Plasmamembranbereichen des Zellsomas und der dendritischen Laube wurden durch systematische Aufnahme aufgenommen, die Bilder wurden geblendet (siehe oben), die jeweiligen Bereiche (E-Fläche, P-Fläche, Eis) wurden bestimmt und die anti -PIP2-Markierungsdichte wurde bestimmt. Für die Analyse wurden alle morphologischen Strukturen verwendet, die eindeutig als Pilzstacheln kategorisiert werden konnten, sowie benachbarte Dendritensegmente, die nicht mit Stacheln verziert waren, d Alle sichtbaren dendritischen Anhaftungen wurden verworfen.

Die Stacheln wurden in Basis, Hals und Kopf unterteilt. Für einige Analysen wurde der Wirbelsäulenkopf weiter in drei Teile zerlegt, indem die Länge des Kopfes in drei gleich hohe Teile geteilt wurde, was zu einem oberen, mittleren und unteren Kopf führte. Die Vorgehensweise bei der Gebietsdefinition war wie folgt: Zuerst wurde die Basis definiert. Es wurde eine Grundlinie gezogen, die die dendritischen Membranpunkte neben der Wirbelsäule miteinander verbindet. Zwei weitere parallele Linien gleicher Länge, die die Grundlinie flankieren, wurden im Abstand von 150 nm eingezeichnet und dann verbunden (90°-Winkel). Die einbezogenen Zellflächen wurden als Grundfläche definiert (siehe auch Abb. 2). Von einer Position, die die Hälfte der Grundlinie darstellte, wurde eine weitere Linie zur Spitze der Wirbelsäule gezogen, um deren Längsachse zu definieren. Rechtwinklig zur Längsachse der Wirbelsäule wurde eine Linie im 90°-Winkel gezogen, um den Hals vom Kopfbereich zu trennen (Abb. 2). Diese Grenze war normalerweise leicht an der zweidimensionalen Verbreiterung des Halses und an der 3D-Information durch die Platinschattierung zu erkennen (Abb. 2). Der Kopfbereich wurde weiter in drei Bereiche (Unterkopf, Mittelkopf und Oberkopf) unterteilt, indem zwei Linien rechtwinklig zur Längsachse an Positionen gezeichnet wurden, die ein Drittel und zwei Drittel der durch die Längsachse definierten Kopflänge widerspiegeln (Abb. 4a). . Alle Bereiche wurden dann mit dem Polygonauswahlwerkzeug in ImageJ/FIJI entsprechend den vordefinierten Grenzlinien bzw. dem Membranprofil umgeben und mit ImageJ vermessen.

Die Anti-PIP2-Immunogold-Markierungen innerhalb jedes Bereichs wurden gezählt und die Markierungsdichte für jede Unterteilung und für einen zusätzlichen dendritischen Membranbereich, der der analysierten Wirbelsäule entspricht, wurde mit ImageJ/FIJI bestimmt. Sofern Beschriftungen direkt an gezeichneten Rändern oder Trennlinien angebracht waren, wurden sie in größerem Umfang dem vom Goldpartikel bedeckten Bereich zugeordnet. Alle erhaltenen Daten, einschließlich hoher Werte und Nullprofile, wurden berücksichtigt. Es wurden keine „Ausreißer“-Analysen durchgeführt und keine „Ausreißer“ aus den Datensammlungen entfernt, da sich die biologische Varianz im gesamten Bereich der ermittelten Markierungsdichten widerspiegelt.

Für zeitaufgelöste Analysen von PIP2-Signalen in Wirbelsäulen- und Inhibitorstudien wurden alle Ergebnisse auf die durchschnittliche Markierungsdichte normalisiert, die in der gesamten Wirbelsäule im Steady-State-Zustand (0 Minuten) festgestellt wurde.

Clusteranalysen wurden unter Verwendung kreisförmiger ROIs mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt. Gemäß den zuvor festgelegten Verfahren22,23,24,77 wurden Cluster als n ≥ 3 Goldpartikel pro ROI definiert.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism durchgeführt. Wenn die Daten unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Tests normalverteilt waren, kann ein Student-t-Test (Vergleiche zweier Bedingungen) oder eine einfaktorielle Varianzanalyse (einfaktorielle ANOVA) mit einem anschließenden Tukey-Mehrfachvergleichstest ( Vergleich von mehr als zwei Bedingungen) durchgeführt.

Wenn der Shapiro-Wilk-Test eine Nicht-Normalverteilung nahelegte, wurde ein Mann-Whitney-Test (für 2 Bedingungen) oder ein Kruskal-Wallis-Test (≥3 Bedingungen) mit anschließendem Dunn-Mehrfachvergleichstest verwendet.

Für Zwei-Faktor-Analysen wurde eine Zwei-Wege-ANOVA in Kombination mit entweder nachfolgenden Mehrfachvergleichstests von Šídák oder Bonferroni durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Informationen zu Quelldaten, in denen alle einzelnen Datenpunkte aufgeführt sind, die den quantitativen Analysen zugrunde liegen, finden Sie in den Zusatzdaten 1.

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Wir danken K. Gluth, A. Kreusch, S. Linde und M. Roeder für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom IZKF und von der DFG gefördert (RTG1715 SP19 und KE685/7-1 an MMK und QU116/9-1 an BQ).

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Institut für Biochemie I, Universitätsklinikum Jena – Friedrich-Schiller-Universität Jena, 07743, Jena, Deutschland

Sarah A. Hofbrucker-MacKenzie, Eric Seemann, Britta Qualmann & Michael M. Kessels

Zentrum für Elektronenmikroskopie, Universitätsklinikum Jena – Friedrich-Schiller-Universität Jena, 07743, Jena, Deutschland

Martin Westermann

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SAH-M. und ES entwarf und führte Experimente durch und interpretierte die Daten. SAH-M. war an Teilen des Manuskripts mitgeschrieben. MW stellte technische Beratung und Zugang zu Techniken und Geräten der Elektronenmikroskopie bereit. SAH-M., ES und MMK visualisierte Daten. MMK führte auf Wunsch bestätigende, unabhängige Untersuchungen durch. BQ und MMK konzipierten das Projekt, entwarfen Experimente, interpretierten die Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Britta Qualmann oder Michael M. Kessels.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Zachary T. Graber und Yugo Fukazawa für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Joao Valente. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hofbrucker-MacKenzie, SA, Seemann, E., Westermann, M. et al. Eine langfristige Depression in Neuronen beinhaltet die zeitliche und ultrastrukturelle Dynamik von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat, die auf PIP5K, PTEN und PLC beruht. Commun Biol 6, 366 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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Eingegangen: 21. Juni 2022

Angenommen: 17. März 2023

Veröffentlicht: 3. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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